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《腺病毒包裝、擴(kuò)增、純化、滴度測(cè)定及感染》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在應(yīng)用文檔-天天文庫(kù)。
1、腺病毒包裝、擴(kuò)增、純化、滴度測(cè)定及感染一、包裝1.包裝細(xì)胞詳情見(jiàn)AD-293Cells.pdf，AdEasy?AdenoviralVectorSystem.pdf（P31-P32）2.細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法一、詳情見(jiàn)Adeno-XExpressionSystem1UserManual.pdf（P28-P29）C0508磷酸鈣法細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑盒.pdf3.病毒收集詳情見(jiàn)AdEasy?AdenoviralVectorSystem.pdf（P34）二、擴(kuò)增詳情見(jiàn)Adeno-XExpressionSystem1UserManual.pdf（P29-P30）三、純化(i)病毒上清（接一、包裝3.病毒收集）.(i
2、i)Add51mlofa50%PEG6000solution.(iii)Add21.7mlofa4MNaClstocksolution.(iv)Add23.3mlofPBS.Thiswillresultinafinalvolumeof300ml.ThefinalPEG6000concentrationwillbe8.5%andthefinalNaClconcentrationwillbeB0.3M.(v)Distributethesampleas150-mlaliquotsintwo250-mlpolypropylenewide-mouthedbottles.(vi)Storethebot
3、tlesat41Cfor1.5h.Mixcontentsevery20–30min.(vii)Centrifugebottlesat7,000gfor10minat41CusingaBeckmanfixed-angelJLA-10.500rotor.(viii)Aftercentrifugation,awhitepelletshouldbevisible.(ix)Carefullydecantthesupernatantandadd1.2mlof50mMTris-HCl,pH7.4,perbottle.Resuspendthepelletsbyvigorouslypipettingliqu
4、idupanddown.(x)Vortexthebottlesvigorouslyfor20–30stofurtherresuspendthepellets.(xi)Transferthevectorsuspensionintoscrew-capmicrofugetubesinaliquotsof100ml.(xii)Snap-freezethetubesincrusheddryiceandstoreat-80。C.a.按照10ml的病毒上清加入2.5ml的50%PEG6000混合；b.加入1.064ml的4M的NaCl混勻；c.加入1.142ml的PBS混勻；d.4°C下，孵育1.5h，
5、每20-30min顛倒混勻；e.4°C下，7000g離心10min。f.小心移除上清，切勿觸動(dòng)白色沉淀，如果白色沉淀出現(xiàn)松動(dòng)，可以在7000g下短暫離心；g.加入原病毒上清1/200to1/100體積的PBS重懸沉淀病毒粒子；h.立即對(duì)濃縮純化的病毒粒子進(jìn)行滴度測(cè)定，并分裝后（50-100ul/管）凍存于-80°C超低溫冰箱中；上述所需試劑配制方法見(jiàn)Production,concentrationandtitrationofpseudotypedHIV-1-basedlentiviralvectors.pdf（P3）一、滴度測(cè)定病毒滴度測(cè)定-針對(duì)有綠色熒光蛋白標(biāo)記的病毒.doc病毒滴度測(cè)定
6、-針對(duì)沒(méi)有綠色熒光蛋白標(biāo)記的病毒.doc二、感染詳情見(jiàn)Adeno-XExpressionSystem1UserManual.pdf（P31）a.感染前24小時(shí)，把細(xì)胞傳代至35mm平皿中，加入完全培養(yǎng)基至終體積3ml，培養(yǎng)過(guò)夜，感染時(shí)，細(xì)胞密度為80–90%；b.把凍存于-80°C的病毒取出并在室溫下凍融；c.用新的完全培養(yǎng)基更換培養(yǎng)液，并加入凍融的病毒粒子（MOI為50-100）和polybrene（4μg/ml），培養(yǎng)液終體積為3ml；d.感染8-24h后，用新3-4ml新完全培養(yǎng)基更換感染培養(yǎng)液；e.感染48小時(shí)后收取細(xì)胞進(jìn)行QPCR檢測(cè)，感染72小時(shí)后收取細(xì)胞進(jìn)行WB檢測(cè)；
