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《慢病毒包裝、純化、滴度測(cè)定及感染.doc》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫(kù)。
1、慢病毒包裝、純化、滴度測(cè)定及感染一、包裝1.包裝細(xì)胞Lenti-X?LentiviralExpressionSystemsUserManual.pdf（P11）;Lenti-X?shRNAExpressionSystemsUserManual.pdf(P16)2.病毒載體及包裝質(zhì)粒病毒載體：DNA組構(gòu)建及中量提??；包裝質(zhì)粒：商品化產(chǎn)品（Lenti-X?LentiviralExpressionSystemsUserManual.pdf（P12）;Lenti-X?shRNAExpressionSystemsUserManual.pdf(P17)）或DNA中
2、量提?。壳拔ㄒ皇褂脕碓矗?；3.細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法一：Lenti-X?LentiviralExpressionSystemsUserManual.pdf（P12）;Lenti-X?shRNAExpressionSystemsUserManual.pdf(P17)；方法二：按照Lipofectamine?LTX&PlusReagent(Cat.No.15338,invitrogen)進(jìn)行，簡(jiǎn)要中文說明如下：a.轉(zhuǎn)染前24小時(shí)，把4–5x106個(gè)293T細(xì)胞傳代至10cm培養(yǎng)皿中，加入完全培養(yǎng)基至終體積10ml，培養(yǎng)過夜，轉(zhuǎn)染時(shí)，細(xì)胞密度為80–90%；b.29
3、3T細(xì)胞轉(zhuǎn)染前2小時(shí)換上9ml新鮮的完全培養(yǎng)基；c.用之前充分混勻PLUSReagent，在EP管中加入15ug的DNA混合物(pLVX-shRNAPlasmidDNA：pMDLg：pRes-Rev：pCMV-VSV-G的摩爾比為1：1：1：1)，15ul的PLUSReagent，用Opti-MEM定容到500ul，標(biāo)記為Tube1，溫和混勻，室溫孵育5分鐘；d.充分混勻MixLipofectamineLTX，在EP管中加入45ul的MixLipofectamineLTX和455ul的Opti-MEM，標(biāo)記為Tube2，溫和混勻；e.將Tube1的溶液
4、加到Tube2中，溫和混勻，室溫孵育5分鐘；Tube1(PlasmidDNA)Tube2(LTX)15ugDNAMIX(pLVX-shRNAPlasmidDNA455μlOpti-MEM：pMDLg：pRes-Rev：pCMV-VSV-G=1:1:1:1)15μlPLUSReagent45μlMixLipofectamineLTXUpto500μlOpti-MEM500μlTotalVolume500μlTotalVolumef.將1ml轉(zhuǎn)染復(fù)合物逐滴加入前一天種好細(xì)胞的100mm皿中，邊加邊搖勻。g.將細(xì)胞放入置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，12
5、小時(shí)后換上新鮮的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。h.轉(zhuǎn)染后48-72h，收取培養(yǎng)上清，500g離心10min或利用0.45μm低蛋白吸附濾膜去除細(xì)胞碎片和團(tuán)聚的病毒；方法三：C0508磷酸鈣法細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑盒.pdf（目前唯一使用方法）1.病毒上清收集轉(zhuǎn)染后12h,48h,72h分別收集一次；一、純化方法一：(i)病毒上清（接一、包裝4.病毒收集）.(ii)Add51mlofa50%PEG6000solution.(iii)Add21.7mlofa4MNaClstocksolution.(iv)Add23.3mlofPBS.Thiswillresultinafinalv
6、olumeof300ml.ThefinalPEG6000concentrationwillbe8.5%andthefinalNaClconcentrationwillbeB0.3M.(v)Distributethesampleas150-mlaliquotsintwo250-mlpolypropylenewide-mouthedbottles.(vi)Storethebottlesat41Cfor1.5h.Mixcontentsevery20–30min.(vii)Centrifugebottlesat7,000gfor10minat41Cusinga
7、Beckmanfixed-angelJLA-10.500rotor.(viii)Aftercentrifugation,awhitepelletshouldbevisible.(ix)Carefullydecantthesupernatantandadd1.2mlof50mMTris-HCl,pH7.4,perbottle.Resuspendthepelletsbyvigorouslypipettingliquidupanddown.(x)Vortexthebottlesvigorouslyfor20–30stofurtherresuspendthep
8、ellets.(xi)Transferthevectorsuspensionintoscrew
