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《應(yīng)用熒光實時定量PCR+方法檢測重組慢病毒滴度及其感染效率》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、第13卷第5期生命科學(xué)研究Vol．13No．52009年10月生LifeScienc命科eResearch學(xué)研究Oct.20020099年應(yīng)用熒光實時定量PCR方法檢測重組慢病毒滴度及其感染效率馬海燕，方彧聃，張敬之*（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，上海市兒童醫(yī)院上海市醫(yī)學(xué)遺傳研究所，中國上海200040）摘要：慢病毒載體已經(jīng)廣泛應(yīng)用于動物模型中基因治療的研究和轉(zhuǎn)基因動物的制備，而準(zhǔn)確地測定重組慢病毒的滴度和感染效率是其關(guān)鍵步驟．通過熒光實時定量PCR的方法定量分析重組慢病毒的顆粒數(shù)以及病毒的活性滴度，并以GFP報告基因的方法作為對照來驗證定量PCR方法的準(zhǔn)確性．研究結(jié)果顯示
2、，應(yīng)用熒光實時定量PCR法與GFP報告基因法測定得到的病毒活性滴度成正相關(guān)，而且前者可以更加準(zhǔn)確地測定病毒滴度和病毒感染效率．關(guān)鍵詞：慢病毒載體；熒光實時定量PCR；病毒滴度；整合拷貝數(shù)；感染效率中圖分類號：Q331文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1007-7847（2009）05-0394-05ANovelMethodfortheDeterminationofRecombinantLentiviralTiterandInfectivitybyqRT-PCR*MAHai-yan，F(xiàn)ANGYu-dan，ZHANGJing-zhi（SchoolofMedicine，Shangh
3、aiJiaotongUniversity，ShanghaiChildren’sHospital，ShanghaiInstituteofMedicalGenetics，Shanghai200040，China）Abstract：Lentiviralvectorisbeingwidelyusedinthestudyofgenetherapyinanimalmodelsandingeneratingtransgenicanimals.However，determinationoflentiviralparticlesandtheirinfectivityisessenti
4、albeforetheirbeingused.SucharequirementcanbeaccuratelyachievedbyqRT-PCR.ReferedbyinfectiousunitsgotfromGFPreporterassay，itshowedapositivecorrelationbetweenthetwoapproaches.Areliable，accurateandrapidmethodisthereforeestablishedforthedeterminationoftherecombinantlentiviraltiterandtheinfe
5、ctivity.Keywords：lentiviralvector；qRT-PCR；viraltiter；integrationcopynumber；infectivity（LifeScienceResearch，2009，13（5）：394～398）慢病毒載體是目前應(yīng)用最廣泛的基因運(yùn)載慢病毒載體均勻分布于基因組內(nèi)，從而降低了其工具之一，在基因治療研究和轉(zhuǎn)基因動物的制備激活原癌基因的幾率［1~3］．重組慢病毒載體既能中已顯示出其廣闊的應(yīng)用前景．慢病毒載體是一感染分裂期細(xì)胞，也能感染非分裂期細(xì)胞［4］．它種反轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中以人類免疫缺陷性病毒可攜帶較大的外源基因（
6、約8kb左右）并穩(wěn)定整（HIV-1）載體研究最為深入．與傳統(tǒng)的小鼠白血合和表達(dá)［5］，加之其誘發(fā)的宿主免疫反應(yīng)相對較病病毒載體（MuLV）偏愛整合入基因5′端相比，?。?］，使得重組慢病毒載體具有較為廣闊的應(yīng)用收稿日期：2009-03-18；修回日期：2009-05-16基金項目：國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃項目（2007AA021206）；國家自然科學(xué)基金資助項目（30870943）；上海市自然科學(xué)基金資助項目（08ZR1412100）作者簡介：馬海燕（1983-），女，山東淄博人，碩士研究生，主要從事病毒載體在轉(zhuǎn)基因動物制備中的應(yīng)用研究；*通訊作者：張敬之（1959-
7、），男，上海人，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳研究所副教授，博士，主要從事分子病毒學(xué)研究，Tel：021-62472308，E-mail：jzhang38@hotmail.com.第5期馬海燕等：應(yīng)用熒光實時定量PCR方法檢測重組慢病毒滴度及其感染效率395前景．1.3病毒RNA的提取無論何種目的使用重組慢病毒，都有必要準(zhǔn)取2μL病毒濃縮液進(jìn)行DNase處理，體系確地檢測病毒滴度．目前，重組慢病毒滴度的檢中加入5μL10×DNaseIBuffer、2μLDNaseI測方法有：依賴于報告基因的GFP熒光檢測法、（5U/uL，TakaraBioInc，Shiga，Japan）
