實時熒光定量PCR+技術的原理及其應用研究進展.pdf

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1、第%’卷第R期中國組織化學與細胞化學雜志Z4@S%’S*4SR.&&2年C月"NT*KOKUVW#*+XVJNTO3V"NKDTO3#Y+*)"Y3V"NKDTO3#Y+?IS.&&2實時熒光定量!"#技術的原理及其應用研究進展!趙煥英$包金風（首都醫(yī)科大學北京神經(jīng)科學研究所，北京市神經(jīng)再生修復重點實驗室，教育部神經(jīng)變性病重點實驗室，北京$%&&&’(）〔關鍵詞〕$實時熒光定量!"#；$熒光標記探針；$)*+結合染料〔中圖分類號〕$,-./0%$$〔文獻標識碼〕$+$$自從%(C/年D?@@E;發(fā)明聚合酶鏈式反應%&=7），報告基團發(fā)出的熒光能被淬滅基團所吸（<4@F7:9

2、B;:86BE=9:B8GE4=，!"#）以來，!"#技術收，并依賴其較高的OP*比值（信1噪比，;EI=B@1很快成為科研、臨床診斷的熱點技術。但是傳統(tǒng)G41=4E;:9BGE4）和良好的辨別能力進行定量檢測。!"#技術在應用中一是不能準確定量，二是容易%0.實時熒光定量!"#幾個重要參數(shù)交叉污染，產生假陽性。直到近年來熒光共振能量!熒光域值（G69:;64@>）：以!"#反應的前%-轉移（H@?49:;8:=8:9:;4=B=8::=:9IFG9B=;H:9，個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，一般熒光域J#K3）技術用于!"#定量后，上述問題才得到較值定義為/Q%-個循

3、環(huán)的熒光信號的標準偏差的［%］好的解決。實時熒光定量!"#（9:B@1GE7:H@?4941%&倍。""G值：也稱循環(huán)閾值，"代表"F8@:，GI:=:GE8L?B=GEGBGEM:!"#，J,1!"#）是在!"#定性代表G69:;64@>。"G值是指樣品管的熒光信號達到技術基礎上發(fā)展起來的核酸定量技術。它是一種在某一固定閾值的!"#反應循環(huán)數(shù)。在!"#循環(huán)過!"#反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積程中，即熒光信號開始由本底進入指數(shù)增長階段的累實時監(jiān)測整個!"#進程，最后通過標準曲線對拐點所對應的循環(huán)次數(shù)。在實際操作中，這個時刻未知模板進行定量分析的方法。該技術不僅實現(xiàn)

4、了也就是每個反應管內的熒光信號到達設定的域值的對)*+模板的定量，而且具有靈敏度高、特異性時刻，可見"G值取決于閾值。#$#=：是指模板和可靠性更強、能實現(xiàn)多重反應、自動化程度高、)*+的起始拷貝數(shù)（圖%所示）。經(jīng)數(shù)學證明，"G無污染性、具實時性和準確性等特點，目前已廣泛值與模板)*+的起始拷貝數(shù)（$#=）成反比。典［.］應用于分子生物學研究和醫(yī)學研究等領域。型的!"#分R給階段（圖.）。%0實時熒光定量!"#技術的概述%0%熒光共振能量轉移原理%((.年NEI?86E等首次提出了采用動態(tài)!"#方法和封閉式檢測方式對目的核酸數(shù)量進行定量分析，熒光探針技術是基于標記基團的J#

5、K3原理而實現(xiàn)的，當某個熒光基團的發(fā)射譜與另一個熒光基團的吸收光譜重疊，且兩個基團距離足夠近時，能圖%$實時熒光定量!"#幾個重要參數(shù)量可以從短波長（高能量）的熒光基團傳遞到長波JEIS%$36:E7<49GB=G

6、9:B@GE7:!"#〔作者簡介〕趙煥英，女（%(2-），漢族，在讀碩士研究生。!通訊作者萬方數(shù)據(jù)（3456478499:;<4=>:=8:;64?@>A:B>>9:;;:>）!第P期!!!!!!!!!趙煥英等X實時熒光定量$%&技術的原理及其應用研究進展P’!!"#實時熒光$%&的分類實時熒光$%&是在擴增產物聚集的過程中連續(xù)檢測，即“實時”檢測，根據(jù)在指數(shù)擴增期的產［’］物量來推算初始模板的拷貝數(shù)。實時熒光定量圖’!45675.探針$%&包括探針類和染料類兩種，探針類是利用與靶?=>X’!45675.$,

7、685.7+*類如()*&+,--./則是利用與雙鏈012小溝結合45685.7+*探針是45685.探針的基礎上改發(fā)光的理化特征指示擴增產物的增加。前者由于增進的，在探針的’’端增加了7+*（8=.<,>,<