一殘毀性掌跖角皮癥家系致病基因突變檢測

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分類號(hào)：R758．7密級(jí)：單位代碼：10422學(xué)號(hào)：2009133370紊力孥碩士學(xué)位論文鼬繃咖愕踟加P胚砂Master’sThesis論文題目：一殘毀性掌跖角皮癥家系致病基因突變檢測DETECTIoNoFGJB2GENEMUTATIoNINAFAMILYWITHVoHWINKELSYNDRoME合作導(dǎo)師：2012年5月16日 原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：所呈交的學(xué)位論文，是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下，獨(dú)立進(jìn)行研究所取得的成果。除文中已經(jīng)注明引用的內(nèi)容外，本論文不包含任何其他個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的科研成果。對本文的研究作出重要貢獻(xiàn)的個(gè)人和集體，均己在文中以明確方式標(biāo)明。本聲明的法律責(zé)任由本人承擔(dān)。論文作者簽名：—型紅日期：—出五以關(guān)于學(xué)位論文使用授權(quán)的聲明本人完全了解山東大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，同意學(xué)校保留或向國家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版，允許論文被查閱和借閱；本人授權(quán)山東大學(xué)可以將本學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或其他復(fù)制手段保存論文和匯編本學(xué)位論文。(保密論文在解密后應(yīng)遵守此規(guī)定)論文作者簽名：巡導(dǎo)師簽名：日 目錄中文摘要????????????????????l英文摘要????????????????????3符號(hào)說明????????????????????5前言????????????????????6材料和方法???????????????????10結(jié)果??．．?????????????????20討論???????????????????··22結(jié)論???????????????????··28參考文獻(xiàn)???????????????????··29論文綜述???????????????????··32致謝???????????????????··40攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄????????????·41 CONTENTSAbstmctinChinese???????????????????????????????????·lAbstractinEnghsh???????????????????????????3SymbolicdesCription??????????????????????????5Preface?????????????????????????????????????????．．6Materials鋤dmemodS?????????????????????????10Results?????????????????????????????????????????20Diseussion???????????????????????????????????????·22Conclusion???????????????????????????????????????28Re詫fence???????????????????????????????????????．．29reⅣiew?????????????????????????????????????????·32Acknowledgement??????????????????????????¨40“stofpublications??????????????????????????41 山東大學(xué)碩上學(xué)位論文一殘毀性掌跖角皮癥家系致病基因突變研究研究生：王占想專業(yè)：皮膚病與性病學(xué)導(dǎo)師：張莉教授中文摘要研究背景殘毀性掌跖角皮癥(MutilantingPalmoplantarKeratoderma)又稱殘毀性遺傳性角質(zhì)瘤(kerato腿hereditariamutilans)，于1929年由德國學(xué)者Vohwinkel首先描述并命名，因此該病又被稱為沃溫克耳綜合癥(Vohwinkelsyndrome，VS，oMIM124500)。它是一種罕見的常染色體顯性遺傳病，多呈家族性發(fā)病，同時(shí)也有散發(fā)病例的報(bào)道。該病好發(fā)于白種人女性，多于嬰幼兒起病，病程呈進(jìn)行性發(fā)展。其典型的臨床表現(xiàn)包括：對稱性彌漫性掌跖角化，掌跖表面呈蜂窩狀小凹餡；手足背部及肘膝關(guān)節(jié)伸側(cè)等可呈典型的海星狀或條狀角化過度斑塊；遠(yuǎn)端指(趾)間關(guān)節(jié)呈環(huán)形縮窄并逐漸斷離(假阿洪病樣改變)。目前己定位克隆鑒定出兩個(gè)與殘毀性掌跖角化病有關(guān)的致病基因：分別是定位在13號(hào)染色體13q“q2上編碼縫隙連接蛋白Cx26的GJB2基因和定位在1號(hào)染色體1q21上編碼兜甲蛋白的LOR基因。由GJB2基因突變導(dǎo)致的殘毀性掌跖角化病常伴有聽力異常，被稱為典型的殘毀性掌跖角化?。挥蒐oR基因突變導(dǎo)致的殘毀性掌跖角化病常伴有魚鱗病，又被稱為變異型殘毀性掌跖角化病。臨床上我們收集到一殘毀性掌跖角化病伴有感音神經(jīng)性耳聾的家系，并對該家系進(jìn)行了致病基因的研究。據(jù)我們所知，本研究為國內(nèi)首次對該病進(jìn)行致病基因突變檢測。目的對一個(gè)中國漢族殘毀性掌跖角化病家系進(jìn)行致病基因突變檢測，以明確其致病基因及突變類型，以期進(jìn)一步明確臨床表型與基因型的關(guān)系。方法收集該家系5例患者、12例正常人和100例健康正常對照外周血標(biāo)本和家系患者臨床資料。用外周血DNA提取試劑盒提取外周血基因組DNA，采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增候選基因GJB2基因的整個(gè)編碼序列和側(cè)翼序列在內(nèi)的1015bp， 山東大學(xué)碩士學(xué)位論文擴(kuò)增產(chǎn)物純化后應(yīng)用ABIPR工SM3730XL自動(dòng)測序儀直接雙向測序，Sequencher4．10．1Demo軟件與基因組序列進(jìn)行比對分析，以明確具體的突變位置和突變方式。結(jié)果PcR產(chǎn)物測序結(jié)果顯示：該家系所有患者GJB2基因均存在一個(gè)雜合錯(cuò)義突變196G—C，導(dǎo)致第一細(xì)胞外區(qū)域(E1)第66位天冬氨酸被組氨酸替代(即D66H)，而家系中12例正常人和100例非家系成員正常對照的DNA測序結(jié)果均未發(fā)現(xiàn)此突變。反向測序結(jié)果亦證實(shí)該突變。結(jié)論該家系所有患者均存在GJB2基因突變(D66H)，此基因?yàn)橐阎臍垰哉契沤瞧ぐY致病基因，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明GJB2基因中D66H錯(cuò)義突變也是中國漢族人群中殘毀性掌跖角化伴耳聾的致病原因之一，可以通過基因診斷和產(chǎn)前診斷阻止致病基因的傳遞。關(guān)鍵詞Vohwinkel綜合癥；皮膚角化病，掌跖；基因GJB2；突變2 山東人學(xué)碩上學(xué)位論文DETECTIoNoFGJB2GENEMUTATIONINAFAMILYWITHVoHWINKELSYNDRoMEGraduates砌a11t：W撕gZhallXiaIlgsp鰣al：Dennat0109ya11dVherologyMelltor：ZhaIlgLiProfessorABSTRACTBackgroundVc}hwiIll(elsyIldrome’also1(Ilown髂MutilamingPalmopl鋤tarKeratod∞n如isararcautosomaldomin鋤tiIllleritodskindisease．npres即tswithseveralcutaIleousm鋤ifestations，such勰dimsehyp酞eratosisofpahs觚dsol髂witllahoneycombappearance，st橢Sh—like蛔atosesandconstrictionbandsleadingt0a：uto鋤putationoft11edi百ts(pseudoai婦)andismosnyr印ortedt0aSsociatedw洫tllemutationsinGJB2g鉍e'wllich饑codescoIlIleXin26(Cx26)，aCompoIleIltof，intercellular卿junctionsandLORgme，whicheIlcodesloricrhl．WenowrepononaGJB2genemutimoninaC蛐1ese細(xì)nilyw弛VollwiIll【elsyndromeandsenS0rin吣ldea血essausori西nallydescmed．T0Ⅱlebestofourhowlcdge，t11isismefirstt0suggest廿1attheD66HmutationinGJB2geneisinV01VedintIlectiologyofC11inescVSwinldea缸essPcdi孕ee．objec咖eT0deteCtthe觚ltationofGJB2gencinaChinese缸nilywimvohwinkelsyndromeanddeamess．MethodsThepedi黟eemelll．bers’clillicaldataandbloodsampleswercc01lected筋m5a腩ctedpatielltsand4lnla腩ctcdindividualsindlc‰ily鋤d1oohealⅡlyc0Il∞D(zhuǎn)ls．GenomicDNAw雒extractod舶mbloodsamples．Polymer嬲echainreaction(PCR)w嬲carricdoutt0鋤pli矽me鉍tireeIlcodingandflankingsequeIlceofGJB2gelleaIldfollowedbybidirectionalsequenCing．Finally’tllemutation鋤alysis3 一．坐奎奎蘭堡±蘭垡笙奎_-__●-●_-●-_l-_-_-_-__-●_-______-●_-_-_●_-_●-●-I____--—___-_—__-————————————————一一一waSproc懿sedbySequ饑ch盯4．10．1D鋤oso舳r缸e．ResultsAheterozygousIIlisseIlsemutation196G-+CinⅡ1eGJB2gene，wmchresultin廿1es1IbstitIltionofAspaIticAcidbyllistidineatcodon66(D66H)onme6rstt咖inalof廿1eprotein，w舔firldoutinallpatientoftllis鼬ily，butinnoneofⅡle4Ilo肌alindividualsiIlthis缸nily鋤d1oohealtllycon的ls．ConclusionsAnD66Hmissense咖tationinnleCX26gcnecallalsocause、，rohwinkclsⅥldromewihdeamessinChineseHanpopulation．KeywordsVohwiIll【elsyndrome；GJB2gelle；DNAsequeIlciIlg；Mutation4 山東大學(xué)碩士學(xué)位論文‘渤ediseasegenomlcsHGPMDADARXRGenescanGenotypcrLillkageSTRHPICVSPPKEPPKPLSDPPSHEDPCROMIM符號(hào)說明基因病基因組學(xué)人類基因組計(jì)劃單基因病常染色體顯性遺傳病常染色體隱性遺傳病X連鎖隱性遺傳基因掃描基因分型連鎖短串聯(lián)重復(fù)序列雜合度多態(tài)信息量殘毀性掌跖角皮癥掌跖角皮癥松解性掌跖角皮癥掌跖角化伴牙周病綜合癥彌漫性掌跖角化病有汗性外胚葉發(fā)育不良多聚酶鏈反應(yīng)人類孟德爾遺傳在線5 山東入學(xué)碩士學(xué)位論文一殘毀性掌跖角皮癥家系致病基因突變研究．‘上--J一刖菁人類健康決定于人自身的遺傳物質(zhì)與其內(nèi)外壞境因素相互作用的平衡，這種平衡可因遺傳物質(zhì)的變異或／和環(huán)境因素的作用而被打破引發(fā)疾病。人類的遺傳物質(zhì)——基因，幾乎參與了所有人類疾病的發(fā)生，它包括易感基因和致病基因。因此，人類疾病在一定程度上也可被稱為基因病(genedisease)。弄清遺傳因素在各種疾病中所處的作用和地位不僅利于揭示疾病的發(fā)病機(jī)制、了解人體內(nèi)外環(huán)境因素對人類健康的影響，而且將對疾病的診斷、治療和預(yù)防等領(lǐng)域帶來深刻的革命。因此，對人類各種疾病(即基因病)的致病基因或易感基因的定位、克隆及結(jié)構(gòu)功能研究成為當(dāng)下人類基因組學(xué)(genomics)研究的主流方向。隨著20世紀(jì)，人類基因組計(jì)劃(HGP)的完成，為21世紀(jì)基因診斷與基因治療技術(shù)的發(fā)展奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。根據(jù)基因改變類型的不同，基因病可分為以下三種類型：單基因病、多基因病以及獲得性基因病。單基因病(monogenicdiesase，MD)是由單個(gè)基因突變引起的一類遺傳性疾病，也是唯一符合孟德爾遺傳方式的疾病。】llD具有數(shù)量多，散發(fā)，危害子代健康的特點(diǎn)。在單基因遺傳病中，遺傳因素起了決定作用，通常呈現(xiàn)特征性的家系傳遞格局，而環(huán)境因素基本不起作用。其包括常染色體顯性遺傳病(autosomaldominantdisorder，AD)、常染色體隱性遺傳病(autosomalrecessivedisorder，AR)、性連鎖遺傳病(sex一1inkeddisorder，XR)，性連鎖遺傳病又分為X連鎖隱性遺傳、X顯性遺傳、Y連鎖遺傳三類。迄今為止，己發(fā)現(xiàn)的單基因遺傳病有一萬多種，目前己分離得到了上千種重要的人類單基因遺傳性疾病的致病基因。隨著分子生物學(xué)及遺傳學(xué)的發(fā)展，對單基因遺傳性疾病的研究方法逐漸成熟，并形成了一套行之有效的研究方法體系，即通過大規(guī)模的全基因組掃描和分型連鎖分析的方法對致病基因進(jìn)行定位克隆研究。全基因組掃描(Genescan)所利用的是在人類基因組上大量存在的微衛(wèi)星位6 山東大學(xué)碩十學(xué)位論文點(diǎn)，其原理是利用特定引物將某條染色體上特定位置的微衛(wèi)星位點(diǎn)擴(kuò)增出來，并進(jìn)行分析。微衛(wèi)星位點(diǎn)即DNA短串聯(lián)重復(fù)序列(shorttandemrepeats，STR)，它廣泛存在于人類基因組中，多位于內(nèi)含子或非翻譯區(qū)中，以2～6bp為單位，串聯(lián)重復(fù)排列，其中以(CA)n為最多見。微衛(wèi)星位點(diǎn)具有高度的多態(tài)性，高雜合度(heterozygosity，H)和多態(tài)信息量(polymorphisminformationcontent，PIC)，并以孟德爾共顯性遺傳。通過PCR方法，這些微衛(wèi)星位點(diǎn)可以被運(yùn)用于單基因、多基因遺傳疾病的相關(guān)基因定位，精密遺傳連鎖作圖，以及個(gè)體之間的鑒別、親子鑒定等方面。微衛(wèi)星位點(diǎn)的高度多態(tài)性和信息量，使該技術(shù)運(yùn)用前景廣闊。(1)作為遺傳標(biāo)記，構(gòu)建遺傳連鎖圖，為基因定位和基因組掃描提供幫助。(2)作為遺傳標(biāo)記進(jìn)行遺傳病的基因定位。當(dāng)遺傳標(biāo)記與致病基因在同一條染色體上而且距離較近時(shí)，會(huì)阻止子代傳遞時(shí)的自由分離，出現(xiàn)連鎖不平衡。因此可通過對遺傳標(biāo)記的檢測，判斷患者是否攜帶致病基因。(3)根據(jù)微衛(wèi)星位點(diǎn)的個(gè)體之間的差別，設(shè)計(jì)以十幾個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)為一組，以個(gè)體間的各位點(diǎn)基因型串聯(lián)編碼?？梢杂糜谂卸▋扇碎g有無血緣關(guān)系，該技術(shù)在用于軍事、法醫(yī)等方面有著遠(yuǎn)大前景。臨床上單基因遺傳性疾病病大多為少見病或罕見病，單從醫(yī)學(xué)的角度看，對該類疾病的分子機(jī)制研究似乎意義不大。實(shí)際上，對單基因遺傳病的研究意義不僅限于闡明其發(fā)病機(jī)制，更重要的是：該類疾病相當(dāng)于天然的基因剔除(功能喪失性突變)或轉(zhuǎn)基因(獲得性功能性突變)的模型，它為人們對重要基因的基因功能研究提供了一些不可多得的模型。通過對該類基因的功能研究，可以讓我們認(rèn)識(shí)它們所處的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上的許多基因，進(jìn)而認(rèn)識(shí)這個(gè)基因相關(guān)的網(wǎng)絡(luò)。這樣，我們就可以尋找各種可能的環(huán)節(jié)來調(diào)控這些基因，為尋找藥物的作用靶點(diǎn)提供線索與思路，為開發(fā)新藥奠定基礎(chǔ)。據(jù)文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)分析皮膚科的單基因遺傳性疾病大約有300余種，其中超過170多種單基因遺傳性皮膚病已明確致病基因，已對近百種疾病的致病基因進(jìn)行了基因定位‘"。掌跖角皮癥(PalmoplantarKeratoderlllaPPK)又稱掌跖角化病(keratosispalmarisetplantaris)，是以手掌和足跖皮膚增厚、角化過度為特點(diǎn)的一組慢性皮膚病口1。該病為一組臨床表現(xiàn)復(fù)雜多變的遺傳性或獲得性皮膚疾病B3，遺傳性掌跖角皮癥大多為常染色體顯性遺傳性疾病，而且其致病基因大7 山東人學(xué)碩上學(xué)位論文多已被克隆鑒定出，如松解性掌跖角化病(EPPK)、Papillon—Lefevre綜合癥(PLS)、彌漫性掌跖角化病(DPPK)(又稱Thost—Unna綜合征)、殘毀性掌跖角皮癥(又稱VohWinkel綜合征VS)、條紋狀角化病、Meleda病(MDM)(又名轉(zhuǎn)移性掌跖角化病)、掌跖角化病伴發(fā)食管癌以及PPK合并耳聾等H嘲。遺傳性掌跖角化病其遺傳方式可為常染色體顯性遺傳、常染色體隱性遺傳以及性連鎖遺傳等。常有家族史，同時(shí)也有散發(fā)病例的報(bào)道。也可以是其他皮膚病如銀屑病、毛發(fā)紅糠疹、痣樣基底細(xì)胞癌綜合癥等或一些全身性疾病的表現(xiàn)(即癥狀性掌跖角皮癥)。因臨床表現(xiàn)、遺傳方式及發(fā)病時(shí)間的不同，構(gòu)成了許多不同的綜合癥。角皮癥常以臨床分類，諸如彌漫性、局限性、條紋狀或點(diǎn)狀等，但是這些類型之間并無絕對的界限，單一疾病的表現(xiàn)可以隨著部位、年齡、性別或職業(yè)而變化。跖部皮損比掌部有更嚴(yán)重或更彌散的趨勢。殘毀性掌跖角皮癥(MutilantingPalmoplantarKeratoderma)又稱殘毀性遺傳性角質(zhì)瘤(keratomahereditaria舢tilans)，是掌跖角皮癥中比較少見的一種單基因遺傳性疾病。于1929年由德國學(xué)者Vohwinkel和Wigley分別對該病進(jìn)行了描述并命名脯71，Vohwinkel所描述的患者為一名24歲白種人女性，其女兒也有類似病史。因此該病又被稱為沃溫克耳綜合癥(Vohwinkelsyndrome，VS，oMIM124500)。它是一種罕見的常染色體顯性遺傳病，好發(fā)于白種人女性，多于嬰幼兒起病，病程呈進(jìn)行性發(fā)展。典型臨床表現(xiàn)包括：彌漫性掌跖角化過度，掌跖表面呈蜂窩狀小凹陷；手足背部及肘膝伸側(cè)等可呈典型的海星狀或條狀角化過度斑塊；遠(yuǎn)端指(趾)關(guān)節(jié)呈環(huán)形縮窄并逐漸斷離(呈假阿洪病樣改變)砸’81。本病常伴有聽力損失或魚鱗病，前者又被稱為典型的殘毀性掌跖角皮癥，后者被稱為變異型殘毀性掌跖角皮癥。但也有同時(shí)伴有先天性耳聾和魚鱗病的報(bào)道呻1。既往對本病的病因、分類及發(fā)病機(jī)制不太明確，近年來隨著分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的發(fā)展，諸多學(xué)者對本病進(jìn)行了相關(guān)基因即編碼縫隙連接蛋白CX26的GJB2基因和編碼兜甲蛋白的LOR基因的研究。Leen們等于1992年克隆了人類GJB2基因全長cDNA，并對該基因進(jìn)行了功能研究。于1996年，Mignonn婦等克隆了該基因，并通過人一鼠體細(xì)胞原位雜交將該基因定位在人13qll—q12上。Hohln21等和Yonedatn31等先后克隆了人LoR基因全長cDNA和該基因，并將其定位在人1q2l上。1997年Kelselln町等對一同時(shí)患有遺傳性掌跖角化病伴深度感音神經(jīng)性耳聾8 山東人學(xué)碩上學(xué)位論文的家系進(jìn)行致病基因檢測時(shí)發(fā)現(xiàn)所有患者GJB2基因均發(fā)生了一個(gè)雜合錯(cuò)義突變101T—C，使Cx26N一末端區(qū)域第34位氨基酸，導(dǎo)致甘氨酸(Gly)被精氨酸(Arg)替代，即M34T突變。1996年，Maestrini等n53收集到來自美國的一殘毀性掌跖角化病伴有魚鱗病的家系，通過連鎖分析的方法將其致病基因定位在編碼兜甲蛋白的LOR基因上，在對LOR基因進(jìn)行序列分析時(shí)發(fā)現(xiàn)有1個(gè)堿基插入(730insG)，導(dǎo)致框移突變，改變了C末端富含甘氨酸一谷氨酸／賴氨酸的翻譯結(jié)構(gòu)，形成異常的兜甲蛋白，從而導(dǎo)致該病的發(fā)生。檢索國內(nèi)外文獻(xiàn)至今共有6個(gè)國家的8個(gè)伴有魚鱗病的殘毀性掌跖角化病家系報(bào)道，共發(fā)現(xiàn)3種突變類型，分別是：730insG，662insT，709insCn糾力。其中730insG是最為多見的突變方式，在報(bào)道的8個(gè)家系中有6個(gè)是這種突變方式。1999年，Maestrini等n81對來自三個(gè)不同國家(英國、西班牙和意大利)的伴有感音神經(jīng)性耳聾的殘毀性掌跖角化病家系連鎖分析及基因序列分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，在所有患者的GJB2基因上均發(fā)現(xiàn)一錯(cuò)義突變，即第196位堿基G—C，致使第一細(xì)胞外區(qū)域第66位密碼子有天冬氨酸被組氨酸替代，從而形成異常的縫隙連接蛋白26，出現(xiàn)異常角化表型。自此，在GJB2基因上相繼共發(fā)現(xiàn)了四個(gè)突變位點(diǎn)與伴有耳聾的殘毀性掌跖角化病有關(guān)，分別是p．Asp66His，p．Glyl30Val，pGly59Ser和Tyr65Hisn8噸¨。檢索國內(nèi)外文獻(xiàn)，自1974年至2011年12月共有約60余篇相關(guān)報(bào)道，且大都為病例報(bào)告，對該病進(jìn)行基因定位研究的僅有十幾篇。國內(nèi)文獻(xiàn)有十余篇，均為病例報(bào)告，尚未見到國內(nèi)對伴有聽力異常的殘毀性掌跖角皮癥進(jìn)行基因突變研究的報(bào)道。我們收集到山東某地的一殘毀性掌跖角化病伴有感音神經(jīng)性耳聾的家系，并對其進(jìn)行了致病基因的研究。9 山東人學(xué)碩上學(xué)位論文1材料和方法1．1臨床資料先證者，女性，20歲。因雙手足、肘膝及臀部起紅斑、丘疹及角化過度斑19年，伴聽力下降3年就診。患者自1歲左右時(shí)無明顯原因于雙側(cè)掌跖部出現(xiàn)紅斑、丘疹及黃色角化過度斑，無明顯自覺癥狀，未予治療。19年來，上述皮損逐漸加重，擴(kuò)展至整個(gè)掌跖部皮膚，呈增厚的淡黃色角化斑塊，表面為蜂窩狀小凹陷。并累及手足背、指趾、肘膝伸側(cè)及臀部等。近10年來，雙手lO指關(guān)節(jié)僵硬，不能屈伸，不能抓握。近5年，遠(yuǎn)端指(趾)關(guān)節(jié)處出現(xiàn)環(huán)形縮窄，末端變細(xì)。近3年出現(xiàn)聽力下降。曾經(jīng)到過多家醫(yī)院就診，均未能明確診斷。自發(fā)病來，全身皮膚無干燥、脫屑；掌跖無惡臭及分泌物；視力無異常；生活基本可以自理。體格檢查：先證者一般情況可，發(fā)育正常，身材偏小，智力正常，視力及眼底檢查未見異常，心肺及肝腎檢查未見明顯異常。皮科所見：雙手足掌跖部彌漫性淡黃色角化過度斑塊，表面呈蜂窩狀小凹陷，雙手指屈曲，不能完全伸直，活動(dòng)受限。(圖1)；手足背部及指趾部可見海星狀角化和條狀角化增生，遠(yuǎn)端指(趾)關(guān)節(jié)可見纖維性縮窄環(huán)，未節(jié)變細(xì)；(圖2)；肘膝伸側(cè)及臀部可見條狀及線狀或斑點(diǎn)狀肥厚性斑塊(圖3)；指(趾)甲變形、肥厚，呈嵴狀拱起。其它部位皮膚粘膜未見異常。輔助檢查：先證者血尿大便常規(guī)及肝腎功血生化檢測未見明顯異常；雙手部X線檢查示：骨質(zhì)部分吸收或消失，病變尤以遠(yuǎn)端指骨最為明顯，末端指骨變尖(圖4)。先證者母親雙手X線檢查顯示：右手小指遠(yuǎn)端指骨已完全消失(5)?；颊呗犃z查示：輕度感音神經(jīng)性耳聾。家系調(diào)查：該家系4代32人中有5人發(fā)病，其中女4人，男1人，無隔代遺傳現(xiàn)象，符合常染色體顯性遺傳(圖6)。該家系所有患者均在1歲左右發(fā)病，癥狀相似(圖7—9)，均表現(xiàn)為：掌跖彌漫性角化過度，表面呈蜂窩狀小凹；肘膝及踝腕關(guān)節(jié)可見線狀或海星狀角化過度斑塊；指趾末節(jié)出現(xiàn)纖維性縮窄環(huán)，并呈進(jìn)行性指(趾)斷癥改變，癥狀進(jìn)行性發(fā)展。所有患者均伴有不同程度的聽力損失。均無魚鱗病，智力、視力正常。家族中其他人情況良好，無其他遺傳病史，無近親婚配。lO 山東大學(xué)碩十學(xué)位論文根據(jù)典型的臨床表現(xiàn)、輔助檢查及家族性發(fā)病特點(diǎn)，本家系患者診斷為殘毀性掌跖角皮癥。先證者給予阿維A30mgqd口服治療，并輔以中藥活血化瘀，局部外用肝素鈉及0．1％迪維霜。兩周后皮損顯著緩解，肥厚性角化斑開始松解脫落，治療6周后皮損已明顯好轉(zhuǎn)，肥厚性的角化斑塊基本完全脫落，露出紅色新生皮面，手指縮窄環(huán)完全消失，指間關(guān)節(jié)活動(dòng)狀況顯著改善，可以完全伸直(圖10)。目前在治療隨訪中。圖l先證者：治療前皮損，雙手學(xué)部彌漫性淡黃色角化過度斑，表面可見蜂窩狀凹陷，指指屈曲，不能完全伸直，手腕部皮損與正常皮膚邊界清晰。圖2先證者：皮損延至雙手背部，治療前皮損，可見條狀或海星狀角化過度斑塊，指指關(guān)‘13．處可見纖維狀收縮環(huán)，遠(yuǎn)：宵端變細(xì)。 山東大學(xué)碩十學(xué)位論文?！粓D3先證者：臀部及膝部皮損，呈點(diǎn)狀或條狀角化過度性斑塊。圖4先證者雙手x表現(xiàn)，掌跖骨質(zhì)脫鈣，遠(yuǎn)端指骨吸收，骨干萎縮。圖5先證者母親手部X線表現(xiàn)，右手小指遠(yuǎn)：肖端指骨缺失。12 山東大學(xué)碩士學(xué)位論文IIll¨IⅣ圖6殘毀性掌跖角皮癥家系圖，箭頭所指為先證者，編號(hào)卜17為本研究對象。圖7先證者外祖母雙手皮損表現(xiàn)：十指基本完全斷離。圖8先證者外祖母雙足跖部皮損表現(xiàn)：彌漫性匍過度，雙小趾斷離?！！?、-，4、√、， 山東大學(xué)碩士學(xué)位論文圖9先證者母親，右側(cè)肘關(guān)節(jié)處典型的海星狀角化過度斑塊。圖10先證者治療6周后雙手皮膚表現(xiàn)：肥厚性角化斑塊已完全脫落，露出鮮紅色的新生皮面，手指縮窄帶已消失，手關(guān)節(jié)活動(dòng)狀況明顯改善，可完全伸直。1．2主要試劑和儀器1．2．1試劑及其來源(1)EDTA抗凝齊0(2)冰乙酸(3)外周血基因組DNA提取試劑盒(4)蛋白酶K(5)異丙醇(6)70％乙醇(7)TAE緩沖液(8)TadDNA聚合酶天根生化科技(北京)有限公司Takara公司14 山東人學(xué)碩上學(xué)位論文(9)DNTPs(10)TadDNA聚合酶Buffer(11)引物合成(12)瓊脂糖(13)DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)1．2．2主要儀器設(shè)備及來源(1)電恒溫水箱(2)渦旋混合器(3)臺(tái)式高速離心機(jī)(4)MettlerAEloo電子天平(5)紫外分光光度儀(6)PCR擴(kuò)增儀(7)DY—A電泳儀(8)UVP凝膠成像儀(9)自動(dòng)測序儀Takara公司(含MgCl2)Takara公司生工生物工程(上海)有限公司．Takara公司北京長風(fēng)儀器儀表公司通達(dá)科技公司上海醫(yī)用分析儀器廠ANDHR一120型日本美國BioRad美國生物公司ABI2700上海康達(dá)電子儀器廠上海思伯明儀器設(shè)備有限公司ABIPRISⅥ3730XL1．2．3主要試劑的配方(1)(酸性)檸檬酸葡萄糖溶液B(ACD)抗凝劑：稱取檸檬酸鈉1．329、檸檬酸O．489、葡萄糖1．479，加雙蒸水至100ml，滅菌后備用。(2)TAE電泳緩沖液(50×濃貯存液)：精確稱取2429Tris-base和100m10．5MdEDTA(pH8．O)，然后加入800ml雙蒸水充分溶解。再加入57．1ml的冰乙酸，充分?jǐn)嚢杌靹?。加雙蒸水定溶至1000ml。(3)2％瓊脂糖凝膠精確稱取0．59瓊脂糖，加入25m1lxTAE溶液，使用微波爐加熱30s至充分溶解(防止暴沸)，等溶液溫度降至大約60℃時(shí)加入2ul溴化乙錠，緩慢搖動(dòng)燒杯使其混勻。將凝膠倒入已水平曹內(nèi)(確保無水泡)，插入梳子，等其自然凝固后使用(至少要20min)。15 1．3主要使用軟件(1)PremierPrimer5引物合成軟件(2)Sequencher4．10．1Demo序列比對軟件1．4實(shí)驗(yàn)方法技術(shù)路線圖經(jīng)知情同意后采集殘毀性掌跖角皮癥患者及其家系成員外周血標(biāo)本正常人外周血標(biāo)本loo份到GJB2基因的基因序列，序列的特異性引物PCR擴(kuò)增包括整個(gè)編碼序列及其側(cè)翼序列在內(nèi)的1015bp0PCR產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳檢測后純化測序，分析測序結(jié)果1．4．1患者家系及正常人外周血基因組DM的抽提使用天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn)的外周血基因組DNA提取試劑盒(目16緲擦船n妙捆幾妙唰洲n妙O—O篡O姍饉慎自、『阱設(shè)CN．1=1、lI吲 山東大學(xué)碩上學(xué)位論文錄號(hào)：DP319—01)提取患者家系及正常人外周血基因組DNA，試劑盒組成：細(xì)胞裂解液CL，緩沖液FG，緩沖液TB，蛋白酶K。表15m1外周血所需緩沖液用量如下(單位u1)血液細(xì)胞裂解液緩沖液FG蛋白酶K異丙醇70％乙醇緩沖液TB5000125002500252500500操作步驟如下：(1)裂解紅細(xì)胞：將抗凝血5m1加入15ml離心管中，加入5m1細(xì)胞裂解液CL，上下顛倒混勻10次左右，4℃下8000rpm離心4分鐘，倒棄上清；(2)再向其中加入7．5ml細(xì)胞裂解液CL，上下顛倒混勻10次左右，8000rpm離心4分鐘，倒棄上清，將離心管倒置在干凈的吸水紙上停留3分鐘，此時(shí)小心確保沉淀在管中；(3)吸取2．5ml緩沖液FG和25u1蛋白酶K預(yù)混；(4)向離心管中加入2．5m1蛋白酶K和緩沖液FG的混合溶液，立即渦旋混勻至溶液無團(tuán)塊；(5)將離心管放入65℃水浴30分鐘，期間顛倒混勻數(shù)次。此時(shí)可見到溶液的顏色從紅色變?yōu)辄S綠色，表示蛋白成分在發(fā)生變性；(6)再向離心管中加入2．5ml異丙醇，上下顛倒20次以上，以充分混勻至出現(xiàn)絲狀或簇狀基因組DNA。4℃下8000rpm離心10分鐘，倒棄上清，將離心管倒置在干凈的吸水紙上停留2分鐘，此時(shí)小心確保沉淀在管中；(7)加入2．5m170％乙醇，渦旋震蕩5秒鐘，4℃下8000rpm離心4分鐘，倒棄上清。重復(fù)該步驟1次；(8)將離心管倒置在于凈的吸水紙上停留10分鐘，確保沉淀在管中?？諝飧稍顳NA沉淀，直至所有液體揮發(fā)干凈。乙醇?xì)埩艋赜绊懞罄m(xù)的PCR反應(yīng)，同時(shí)應(yīng)避免過分干燥DNA沉淀，因?yàn)檫^于干燥的DNA很難溶解；(9)向離心管中加入500ul緩沖液TB，低速渦旋5秒鐘，放入65℃水浴加熱1小時(shí)溶解DNA，期間輕彈數(shù)次助溶；(10)測定DNA濃度的：吸取DNA原液1肛l，用紫外分光光度儀檢測260nm和280nm的吸光度，計(jì)算oD值和DNA原液濃度；(“)稀釋DNA：按已測的DNA原液濃度，把所有樣本的基因組DNA稀釋成50ng／肛l17 山東大學(xué)碩十學(xué)位論文的濃度，一20度保存，以備下后續(xù)PCR反應(yīng)使用。1．4．2PCR引物設(shè)計(jì)原則．PCR擴(kuò)增特異性和擴(kuò)增效率兩者間相反相成，引物設(shè)計(jì)的目的是在擴(kuò)增特異性和擴(kuò)增效率兩者間取得平衡，其部分基本原理如下：(1)引物長度：一般為15—30bp，常為20bp左右，最長應(yīng)不大于38bp。引物長度是決定退火溫度(Tm值)的最重要因素，以下公式可以粗略計(jì)算引物的Tm值：當(dāng)引物長度小于20bp時(shí)，Tm值=[4(G+C)+2(A+T)卜5℃；當(dāng)引物長度大于20bp時(shí)，Tm值=62．3℃+0．4l℃(％G—C)一500／length一5℃。使用確保Tm值不低于54℃的最短的引物可獲得最好的擴(kuò)增效率和擴(kuò)增特異性，從而優(yōu)化PCR反應(yīng)。(2)引物中的GC含量：引物中G+C含量以40一60％為宜，含量太少擴(kuò)增效果不佳，過多易出現(xiàn)非特異條帶。引物中四種堿基最好隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的相同堿基成串排列，否則容易導(dǎo)致錯(cuò)配。(3)Tm值：退火溫度需要比解鏈溫度大約低5℃左右，如果引物較短，可以適當(dāng)提高Tm值，這樣可以使PCR擴(kuò)增的特異性增加；如果引物較長，那么可以適當(dāng)降低Tm值，使DNA雙鏈結(jié)合。一對引物的Tm值相差5℃左右一般不會(huì)影響PCR的產(chǎn)率，理想情況下引物的退火溫度是一樣的，可以在55℃～75℃間變化。(4)避免兩條引物間互補(bǔ)，尤其是3’末端的互補(bǔ)，否則會(huì)形成引物二聚體，從而產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶，同時(shí)應(yīng)避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)。(5)△G值：指DNA雙鏈形成時(shí)所需的自由能，它反映了DNA雙鏈結(jié)構(gòu)其內(nèi)部堿基對的相對穩(wěn)定性。應(yīng)該選用3’末端△G值較低(絕對值不應(yīng)超過9)，而5’末端和中間位置△G值相對較高的引物。引物3’末端的△G值過高，容易在錯(cuò)配位點(diǎn)形成雙鏈結(jié)構(gòu)從而引發(fā)DNA的聚合反應(yīng)?？傊?，引物設(shè)計(jì)有至少要遵循3條基本原則：(1)引物與模板的序列緊密互補(bǔ)；(2)引物與引物之間避免不能形成二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)；(3)引物不能在非目的位點(diǎn)發(fā)生DNA的聚合反應(yīng)(即錯(cuò)配)。1．4．3PCR(聚合酶鏈反應(yīng))擴(kuò)增(1)模板：患者家系及正常人外周血基因組DNA(50ng／p1)。(2)擴(kuò)增候選基因：通過美國國家生物信息中心(nationalcenterfor 山東大學(xué)碩士學(xué)位論文biotechnologyinfo瑚ation，NCBI)的基因庫檢索到GJB2基因序列，GJB2基因共有2個(gè)外顯子，氨基酸編碼序列僅在第2個(gè)外顯子上，編碼區(qū)有68lbp，編碼226個(gè)氨基酸。嚴(yán)格按照引物設(shè)計(jì)原則，應(yīng)用PremierPrimer5軟件設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增包括整個(gè)編碼序列及側(cè)翼序列的1015bp，其上游引物57—-ACCTGTTTTGGTGAGGTTGTG一37；]：游弓I物57一CCATTGTGGCATCTGGAGTT一37，由-J己海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。(3)PCR反應(yīng)體系表225ul反應(yīng)體系反應(yīng)物反應(yīng)體積(u1)TaKaRaTaqHS(5U／u1)10×PCRBuffer(M92+plus)dNTPMixture(各2．5mM)ForwardPrimer(10uM)ReversePrimer(10uM)基因組DNA(50ng／p1)ddH。O0．152．52．O0．51．O18．35總體積25．0(4)PCR反應(yīng)條件stepl：94℃預(yù)變性5分鐘step2：94℃變性30秒step3：58℃退火30秒step4：72℃延伸30秒step5：gotostep2，35cyclesstep6：72℃延伸7分鐘step7：4℃foreverstep8：endPCR反應(yīng)在(美國生物公司ABI2700)熱循環(huán)儀上完成1．4．4嬲瓊脂糖凝膠電泳檢測PcR擴(kuò)增產(chǎn)物19 山東火學(xué)碩}?學(xué)位論文取2ulPCR擴(kuò)增產(chǎn)物，通過2％瓊脂糖凝膠電泳檢測分析。電泳緩沖液：1xTAE電泳條件：電壓120v，時(shí)I、白J25分鐘UVP凝膠成像儀下觀察并記錄結(jié)果。1．4．5PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接雙向測序分析將所有患者及『F常人PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至北京華大基因研究中心純化后直接雙向測定DNA序列，測序引物為PCR擴(kuò)增時(shí)的正反雙向引物，所用儀器為ABIPRISM3730XLDNA自動(dòng)測序儀。1．4．6測序結(jié)果比對分析使用Sequencher4．10．1Demo軟件將測序結(jié)果與基因數(shù)據(jù)庫中公布的基因組標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對分析，查找有無突變，并進(jìn)一步明確具體突變位點(diǎn)和突變方式，從而判斷氨基酸編碼序列的改變。1．4．7突變位點(diǎn)的證實(shí)(1)將患者目的片段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行正反雙向測序，明確突變位點(diǎn)。(2)隨機(jī)抽取100位健康正常人的外周血標(biāo)本，使用DNA提取試劑盒提取外周血基因組DNA，PCR擴(kuò)增GJB2基因突變位點(diǎn)附近的基因組序列，擴(kuò)增產(chǎn)物純化后用ABIPRISM3730XL自動(dòng)測序儀測序，并進(jìn)行序列比對分析。2結(jié)果2．1PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用同1對引物逐一擴(kuò)增殘毀性掌跖角皮癥患者家系成員及健康正常人GJB2基因全部編碼區(qū)外顯子序列和部分側(cè)翼內(nèi)含子序列，均得到預(yù)期長度的DNA目的片斷。(圖11)圖11PCR產(chǎn)物的電泳圖像：卜5為殘毀性掌跖角皮癥家系中患者，6—7為家系中正常人。20 山東大學(xué)碩士學(xué)位論文2．2DNA雙向測序結(jié)果將所有患者及正常人測序結(jié)果利用Sequencher4．10．1Demo軟件與基因庫公布的GJB2基因序列進(jìn)行比對分析發(fā)現(xiàn)：該家系所有患者GJB2基因均存在一個(gè)雜合錯(cuò)義突變196G—C(圖12)，導(dǎo)致第一細(xì)胞外區(qū)域第66位天冬氨酸被組氨酸替代(即D66H突變)，而家系中12例健康正常人及100例非本家系成員健康正常對照的DNA測序結(jié)果均未發(fā)現(xiàn)此突變，從而證明D66H突變不是多態(tài)性。GTGTGcTACGATC^CTACTC(a)健康正常對照的GJB2基因正向測序結(jié)果(對應(yīng)63—69位密碼子)。cTG-rCC?rACc^TC^CTACTC(b)所有患者GJB2基因正向測序顯示：196G—C雜合突變，導(dǎo)致第一細(xì)胞外區(qū)域第66位天冬氨酸被組氨酸替代(即D66H突變)。(c)健康正常對照GJB2基因反向測序結(jié)果。2l 山東大學(xué)碩士學(xué)位論文GT▲eTG^T■■tGT^GC^c(d)所有患者GJB2基因反向測序結(jié)果顯示：196C—G雜合突變，同樣證實(shí)D66H突變。圖12殘毀性掌跖角皮癥患者及健康正常對照的GJl32基因正反雙向測序結(jié)果3討論現(xiàn)代分子遺傳學(xué)認(rèn)為，基因是DNA分子上具有遺傳效應(yīng)的核苷酸序列的總稱，是具有遺傳效應(yīng)的DNA片段。在染色體上基因呈線性排列，不僅通過復(fù)制可向下一代傳遞信息，使子代與親代表現(xiàn)出相似的性狀，還可使遺傳信息得到表達(dá)，以一定的方式反映到蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上?；驒z測是通過探測基因的存在，分析基因的缺陷及表達(dá)功能是否正常，從而對疾病做出診斷，為后續(xù)的早期干預(yù)、早期治療及遺傳咨詢做準(zhǔn)備。幾乎所有人類疾病都與遺傳因素(即基因)有關(guān)系，在遺傳因素與環(huán)境因素相互作用下導(dǎo)致疾病的發(fā)生。因此大多人類疾病又可以被稱為基因病，基因病在臨床上可分為以下三類：單機(jī)因病、多基因病和獲得性基因病。單基因病的研究方法主要是：在全基因組掃描之后進(jìn)一步做基因定位研究，動(dòng)態(tài)圖變、同胞對法、連鎖和連鎖不平衡分析法及候選基因法，其中最常用的是連鎖分析的方法。全基因組掃描的方法可以確定是否有基因突變，能夠提供突變基因所在區(qū)域的信息，但是該方法不能確定突變的類型及其精確的突變位置。隨后的DNA測序分析變可明確突變類型及準(zhǔn)確的突變位置，從而明確疾病的致病基因。臨床上我們收集到一殘毀性掌跖角化病(MutilantingPalmoplantarKeratoderma)伴有感音神經(jīng)性耳聾家系，該家系在遺傳方式上有以下特點(diǎn)：1．患者雙親之一是患者；2．同胞中患者的比例大約為二分之一；3．連續(xù)傳遞，無隔代遺傳現(xiàn)象，符合常染色體顯性遺傳的特點(diǎn)。臨床表現(xiàn)有如下特點(diǎn)：所有患者均在1～2歲左右開始掌跖部位出現(xiàn)紅斑、丘疹和淡黃色角化過度性增生，此時(shí)身體其它部位皮膚未見角化過度性皮損，上述癥狀逐漸加重，掌跖部出現(xiàn)彌漫性角22 山東大學(xué)碩士學(xué)位論文化過度斑塊，表面可呈典型的蜂窩狀小凹，致使患者雙手指指屈曲，不能完全伸直，活動(dòng)受限。皮損呈進(jìn)行性發(fā)展，逐漸向指(趾)部及手足背部蔓延，邊界清晰，同時(shí)皮損可延至肘膝部、臀部等。手足背部、肘膝關(guān)節(jié)及踝關(guān)節(jié)等處可見典型的海星狀角化過度斑塊。指甲變形、肥厚，呈嵴狀拱起。該家系中所有患者均在10歲左右開始指(趾)關(guān)節(jié)處出現(xiàn)纖維性收縮環(huán)，尤以遠(yuǎn)節(jié)端較重，并逐漸出現(xiàn)指(趾)斷離(即假阿洪病樣改變)。家系患者中均伴有感音神經(jīng)性耳聾，隨著年齡的增大，耳聾程度逐漸加重。所有患者均未伴有魚鱗病，毛發(fā)、牙齒及出汗均無異常，智力及視力正常，可與綜合癥型掌跖角化病如：Pap011in—Lefevre綜合征(PLS)、有汗性外胚葉發(fā)育不良(hidroticectodermaldysplasis，HED)等鑒別口2’231。與國內(nèi)大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道不同的是，本家系患者皮損中均無糜爛、滲出及惡臭味分泌物等隨棚3。該病在發(fā)病初期尚未出現(xiàn)環(huán)形縮窄時(shí)，需要與其它遺傳性掌跖角化病相鑒別。以上幾種綜合癥型遺傳性掌跖角化病癥狀相互重疊，有時(shí)單從臨床不易區(qū)分，因此可以通過基因檢測以明確臨床診斷。自1929年，Vohwinkel首次對本病描述并命名以來國內(nèi)外共有60余篇對本病的報(bào)道，該病多于嬰幼兒起病，好發(fā)于白種人女性，參考文獻(xiàn)多呈家族性發(fā)病，為常染色體顯性遺傳，同時(shí)也有散發(fā)病例報(bào)道淵。本病主要皮膚表現(xiàn)有：①掌跖角化：在嬰幼兒期，首先于掌跖部出現(xiàn)紅斑或斑塊狀角化過度，并進(jìn)行性發(fā)展，呈彌漫性分布，表面呈蜂窩狀小凹，并向手足背、腋窩、踝、肘、膝及足底等處擴(kuò)展。肘膝及踝等關(guān)節(jié)處呈特殊的海星狀或條狀角化過度斑。②假阿洪病樣改變：發(fā)病約4—5年后，患者指(趾)遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)處發(fā)生纖維性收縮窄帶，并呈進(jìn)行性指(趾)斷癥改變，(約10余年)，以小指(趾)最多見，最終可有幾個(gè)指(趾)被累及，且出現(xiàn)環(huán)形縮窄的時(shí)間似乎與掌趾角化的程度無關(guān)。③合并癥：患者掌趾皮膚常因高度角質(zhì)增生、多汗或指(趾)部縮窄而誘發(fā)皸裂、浸漬或感染，并導(dǎo)致疼痛和活動(dòng)障礙。X線檢查：掌指骨質(zhì)脫鈣，有營養(yǎng)性股萎縮，遠(yuǎn)端指(趾)股吸收，骨干縮窄。組織病理：表皮角化過度、角化不全，顆粒層曾厚，棘層肥厚，表皮突延長，真皮血管周圍可見少量炎細(xì)胞浸潤。本病可以同時(shí)伴有其它皮膚表現(xiàn)：①甲改變：指(趾)甲可有嵴狀拱起、殘缺不全、甲彎曲及甲營養(yǎng)不良。②在一些受累個(gè)體可以見到彌漫性廣泛性魚鱗病樣皮膚病，由于兜甲蛋白突變而聽力正常的類型是特異的。③聽力異常：高頻性 山東大學(xué)碩士學(xué)位論文耳聾、聽覺喪失、聾啞，本病經(jīng)常伴隨輕微至中等感覺神經(jīng)性聽力喪失。④頭發(fā)生長異常：瘢痕性禿發(fā)、⑤口周脂溢性鱗屑、表皮松解性角化過度、白癜風(fēng)、癲癇、暗紅色角化斑及腋窩浸漬性白斑等，還能合并癲癇、性功能減退及脊髓空洞癥等‘拍’2釘。如果殘毀性掌跖角皮癥合并腔口部位皮膚黏膜的角化，則稱為0lmstedSyndrome。它也屬于常染色體顯性遺傳的彌漫性掌跖角皮癥，可伴有關(guān)節(jié)松弛和脫發(fā)，多見于男性，在腔口周圍(尤其是口周和肛周)及臀部可見到對稱的、黃褐色角化過度性斑塊和丘疹。其它臨床表現(xiàn)可伴有關(guān)節(jié)松弛、彌漫性脫發(fā)、甲營養(yǎng)不良及口腔黏膜白斑等啪1。目前本病分型尚不明確，根據(jù)伴隨癥狀將其分為兩種：(1)伴聽力損傷的為經(jīng)典型；(2)伴魚鱗病者為變異型，后者一般沒有海星狀角化損害。但最近也有報(bào)道兩者均伴有或者均不伴有的病例。因此其臨床分型尚待進(jìn)一步研究。隨著分子遺傳學(xué)的發(fā)展，可按考慮照突變類型進(jìn)行分類。至今該病沒有統(tǒng)一診斷標(biāo)準(zhǔn)，總結(jié)本病特點(diǎn)及參閱文獻(xiàn)報(bào)道船罔瑚1認(rèn)為其診斷通常依據(jù)以下5點(diǎn)：(1)幼兒期發(fā)病，女性多見；(2)彌漫性掌跖角化過度，表面呈蜂窩狀小凹；(3)手足背的皮損呈特殊的海星狀角化或線狀角化，可延之肘、膝、等處：(4)假阿洪病樣改變，常先從小指(趾)發(fā)生纖維性收縮帶，并呈進(jìn)行性指(趾)斷癥改變；(5)X線檢查：掌趾骨質(zhì)脫鈣，有營養(yǎng)性骨萎縮，遠(yuǎn)端指(趾)骨吸收，骨干萎縮。此外，不同病例尚可伴有不同的相關(guān)癥狀，如不同程度的魚鱗病、耳聾等。到目前為止，共發(fā)現(xiàn)兩個(gè)與殘毀性掌跖角皮癥相關(guān)的致病基因，一個(gè)是編碼連接蛋白26的GJB2基因，定位于13q11—12上；另一個(gè)是編碼兜甲蛋白的LOR基因，定位于1q21。臨床表型上前者常伴有聽力損害，與1929年Vohwinkel首次對本病的描述相同，因此伴聽力異常的殘毀性掌跖角皮癥又被稱為經(jīng)典型殘毀性掌跖角皮癥；后者常伴有先天性魚鱗病，不同于前者，此類型聽力無異常，被稱為變異型殘毀性掌跖角皮癥。GJB2基因在1992年被克隆出并定位于染色體13q11一q12上，該基因全長4804bp，編碼區(qū)為678bp，含2個(gè)外顯子，但編碼區(qū)僅位于下游外顯子上，編碼含有226個(gè)氨基酸縫隙連接蛋白26(Cx26)，因此很容易通過PCR擴(kuò)增并測序分析。 山東大學(xué)碩士學(xué)位論文1997年人們發(fā)現(xiàn)GJB2基因與遺傳性非綜合征性耳聾(NSHI)關(guān)系密切相關(guān)，而且經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)235delC是該病最常見的突變類型。經(jīng)免疫組化證實(shí)，在聲音傳導(dǎo)過程中內(nèi)耳非感覺上皮細(xì)胞和組織細(xì)胞表達(dá)的Cx26蛋白，對K+經(jīng)內(nèi)耳毛細(xì)胞循環(huán)回流進(jìn)入耳蝸內(nèi)淋巴液起調(diào)控作用。GJB2基因突變后導(dǎo)致K+進(jìn)入內(nèi)淋巴液受阻，從而導(dǎo)致感音神經(jīng)性耳聾。隨后研究發(fā)現(xiàn)大約一半以上的遺傳性非綜合癥性耳聾患者是由GJB2基因突變所致，因此該基因已作為先天性耳聾患者的常規(guī)篩查基因。Cx26是縫隙連接大家族中的一員，屬于§一2型縫隙連接蛋白?？p隙連接存在于幾乎所有類型的細(xì)胞表面，為電突觸的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，它是相鄰細(xì)胞膜間信細(xì)傳遞的通道，只允許細(xì)胞間離子及小于lKD的代謝小分子物質(zhì)通過。當(dāng)細(xì)胞接受刺激后，細(xì)胞膜內(nèi)外電勢改變，縫隙連接通道開放，將離子及其它調(diào)節(jié)物質(zhì)(如第二信使)傳遞給相鄰細(xì)胞，使之產(chǎn)生相應(yīng)反應(yīng)。每個(gè)縫隙連接由相鄰細(xì)胞間包膜上的連接子(connexon)錨定形成，每個(gè)連接子又有六個(gè)相同或不同的縫隙連接蛋白組成，它可以調(diào)節(jié)通道的開閉，從而選擇性讓小分子物質(zhì)通過?？p隙連接蛋白(connexin，Cx)是縫隙連接的物質(zhì)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，參與細(xì)胞間信息傳遞、物質(zhì)運(yùn)輸及生長調(diào)控等，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，它與腫瘤的發(fā)生關(guān)系密切。迄今為止，在縫隙連接蛋白大家族中至少發(fā)現(xiàn)了20多個(gè)成員，分子量均在26～56KD之間，分為Q～Cx和B_Cx。連接蛋白有著共同的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)：四次跨莫將其分為五個(gè)區(qū)，即N端、C端區(qū)，跨膜區(qū)(TM卜4)，細(xì)胞外區(qū)(E1和E2)，細(xì)胞內(nèi)區(qū)(CL)。N端與TMl之間的胞內(nèi)區(qū)構(gòu)成電壓感受器的電荷復(fù)合體，E1與E2區(qū)決定連接蛋白之間的相容性，CL和C端區(qū)與間隙連接通道的PH門控有關(guān)。連接蛋白基因突變可產(chǎn)生無功能或功能缺陷的連接蛋自，使縫隙連接缺損，通道開閉異常，從而導(dǎo)致細(xì)胞間信息傳遞受阻或紊亂。1999年，Maestrini等n胡對三個(gè)來自不同國家(英國、西班牙和意大利)的殘毀性掌跖角化病伴感音神經(jīng)性耳聾家系進(jìn)行研究時(shí)，通過連鎖分析首次將本病的致病基因定位在13號(hào)染色體q11一q12上，在對GJB2基因進(jìn)行基因序列分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，在三個(gè)毫無關(guān)系的家系中所有患者的GJB2基因均存在一個(gè)雜合錯(cuò)義突變196G—C，導(dǎo)致第一細(xì)胞外區(qū)域第66位天冬氨酸被組氨酸替代(即D66H突變)，而家系中所有正常人的GJB2基因測序結(jié)果均未發(fā)現(xiàn)此突變。此結(jié)果說明D66H 山東人學(xué)碩士學(xué)位論文是殘毀性掌趾角皮癥伴感音神經(jīng)性耳聾的致病基因，導(dǎo)致Cx26分子的第1個(gè)細(xì)胞外區(qū)的1個(gè)高度保守的殘基發(fā)生改變，進(jìn)而干擾連接小體的組裝，以及Cx分子錨定于鄰近細(xì)胞和在縫隙連接中所起的門控功能。進(jìn)一步研究表明所有患者均為攜帶該突變基因的雜合子個(gè)體，由此作者證實(shí)該突變?yōu)槌Ｈ旧w顯性遺傳性聾的病因之一。2005年，RikkertL．Snoeckx等n們在分析埃及耳聾患者中GJB2基因突變時(shí)，其中有一個(gè)伴有Vohwinkel綜合癥的家系，患者為父子兩人，均有彌漫性掌跖角化伴深度感音神經(jīng)性耳聾，父親右足的第2，3趾有纖維性縮窄環(huán)，即假一阿洪病樣表現(xiàn)。在對該家系進(jìn)行GJB2基因序列分析時(shí)發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的突變位點(diǎn)p．G1y130Val(G130V)，此點(diǎn)是位于GJB2基因高保守區(qū)域的一個(gè)顯性突變。該家系正常人中未發(fā)現(xiàn)此突變。據(jù)說GJB2基因的顯性突變導(dǎo)致聽力異常和皮膚病可有不同程度外顯率口¨，所以該家系中兒子未有典型的假阿洪病樣表現(xiàn)。在VS致病基因中，G130V是唯一位于GJB2基因的第二細(xì)胞外區(qū)域的突變位點(diǎn)。2006年，Marie—LouiseBondeson等嘲對瑞典一VS患者做GJB2基因突變檢測時(shí)發(fā)現(xiàn)另一個(gè)新的突變位點(diǎn)p．Gly59Ser(G59S)，患者為一60歲的老年男性，掌跖彌漫性角化過度增生，呈蜂窩狀小凹，指趾可見假阿洪病樣改變，同時(shí)伴有先天性聾啞和泛發(fā)全身的魚鱗病。突變點(diǎn)位于GJB2基因的第一個(gè)高度保守序列的非保守突變。該患者父母早逝，無子女，G59S為一新發(fā)突變，并最終發(fā)展為基底細(xì)胞癌和鱗狀細(xì)胞癌。該患者患有典型的殘毀性掌跖角皮癥癥狀，但同時(shí)伴有先天性耳聾與魚鱗病，因此GJB2基因上G59S突變是如何導(dǎo)致本病還需要進(jìn)一步研究。2011年，deZwart—Sto瑚乜¨等，發(fā)現(xiàn)了第四個(gè)引起殘毀性掌趾角皮病的突變位點(diǎn)，p．Tyr65His(Y65H)，該位點(diǎn)與99年Maestrini等發(fā)現(xiàn)的突變位點(diǎn)(D66H)緊緊相鄰，相鄰的兩個(gè)密碼子突變引起相同的臨床表型，這在GJB2基因上還是第一次見到。同時(shí)該學(xué)者通過研究發(fā)現(xiàn)：Y65H突變形成的變異型Cx26D蛋白的結(jié)構(gòu)及在細(xì)胞中的分布異常，且有縫隙連接蛋白26形成的縫隙連接對燃料的轉(zhuǎn)移較野生型Cx26明顯減少。至今，在GJB2基因上共發(fā)現(xiàn)以上4種突變類型與典型殘毀性掌跖角皮癥有關(guān)，均為單一堿基雜合錯(cuò)義突變，說明部分氨基酸殘基在該病的發(fā)生發(fā)展中起著 山東大學(xué)碩上學(xué)位論文重要的作用。有研究報(bào)道，D66H和Y65H突變形成的突變型Cx26在細(xì)胞中分布和結(jié)構(gòu)異常，導(dǎo)致其形成的縫隙連接通道功能障礙，采用細(xì)胞熒光免疫示蹤法(parachuteassay)檢測到由突變型Cx26構(gòu)成的連接通道對染料的轉(zhuǎn)移較野生型Cx26明顯減少n8_k3¨。LOR基因編碼兜甲蛋白，于1992年，Yonedatn∞等通過原位雜交將該基因定位在1q2l上，mRNA全長1197bp，編碼316個(gè)氨基酸。兜甲蛋白是構(gòu)成角質(zhì)化細(xì)胞膜的主要蛋白，一種富含甘氨酸的堿性蛋白質(zhì)，位于表皮顆粒層的淺部，通過轉(zhuǎn)基因鼠的功能分析發(fā)現(xiàn)突變的異種兜甲蛋白在顆粒細(xì)胞核內(nèi)蓄積進(jìn)而影響隨后的表皮分化而導(dǎo)致皮膚病的發(fā)生。伴有魚鱗病的殘毀性掌跖角皮癥較伴有聽力異常的更為少見，至今，國內(nèi)外共發(fā)現(xiàn)8個(gè)患該病的家系，3種突變類型，分別是：730insG，662insT和709insCn¨"，均為單一堿基插入突變。8個(gè)家系中有6個(gè)家系的突變方式為730insG，可見在LOR基因上730insG是導(dǎo)致該病的熱點(diǎn)突變。730insG突變導(dǎo)致移碼突變和異常的C末端，改變了C末端84個(gè)氨基酸并且比野生型兜甲蛋白增加了22個(gè)氨基酸，致使富含谷氨酸／賴氨酸的序列改變?yōu)楦缓彼幔涟彼嵝蛄?，此結(jié)果同樣出現(xiàn)在4個(gè)不同的國家(英國、日本、蘇格蘭、德國)中，說明在不同的種群中存在相同的突變熱點(diǎn)。在僅有耳聾的vS家系中未發(fā)現(xiàn)該突變，說明此突變僅存在于伴魚鱗病的VS家系中。本病為殘毀性的，并可引起疼痛等其它不舒服的癥狀，嚴(yán)重影響了患者的身心健康，早期干預(yù)可以獲得較好的近期療效，因此，對可疑患者應(yīng)早診斷，早治療。由于本病較為罕見，對其治療的報(bào)道更為少見，缺乏長期的臨床觀察?？偨Y(jié)歷年來的文獻(xiàn)報(bào)道，本病治療后近期療效較好，遠(yuǎn)期預(yù)后不明確，而且只是對癥治療，局部的角質(zhì)剝脫劑和系統(tǒng)應(yīng)用阿維a酯、異維A酸等治療角化過度的首選，口服維A酸類卜2個(gè)月可見角化過度及纖維環(huán)明顯緩解㈨。但是長期應(yīng)用維A酸類所引起的一些副作用也不得不重視，如對骨骼的毒性限制了阿維a酯的使用。外科重建治療假阿洪病樣損害：手術(shù)治療主要針對指(趾)的環(huán)形縮窄及假阿洪病樣損害，手術(shù)方法主要包括：收縮帶的松解和z字成行術(shù)、皮膚移植術(shù)，晚期施行截肢術(shù)∞朋1。到目前僅有5例文獻(xiàn)報(bào)道是關(guān)于外科治療的，前三例報(bào)道是應(yīng)用上述外科矯 山東大學(xué)碩士學(xué)位論文治的方法治療后都有很高的再發(fā)率和遠(yuǎn)期療效不滿意。2009年，SinhaM側(cè)等報(bào)道了兩例外科治療后并分別隨訪5年和8年，預(yù)后較前改善。用于緩解攣縮皮膚的全皮移植手術(shù)的遠(yuǎn)期移植瓣易變得腫脹，引起局部疼痛而不得不多次外科修復(fù)，外科矯治很容易做到，但是很難保持，常得不到滿意的療效。因此他們認(rèn)為：外科治療應(yīng)注重神經(jīng)血管的修復(fù)。2010年，BassettoFm3等對另一患者左手第五指的環(huán)形縮窄應(yīng)用鄰指皮瓣治療，隨訪18個(gè)月，效果滿意。我國學(xué)者蔣建華報(bào)道一例，應(yīng)用大劑量丹參滴注以改善末梢微循環(huán)，內(nèi)服維生素AD和角質(zhì)剝脫劑維胺酯膠囊，局部用尿素軟膏和水楊酸軟膏封包，治療2個(gè)月，癥狀明顯改善口副。綜上所述，本病的治療上尚沒有特效方法，應(yīng)根據(jù)患者的具體情況盡早綜合治療，盡可能減少副作用的發(fā)生，提高患者生存質(zhì)量。外科手術(shù)尚有待進(jìn)一步研究。本研究中致病基因的確定可用于產(chǎn)前診斷，阻止其在該家系中傳遞，從而優(yōu)化家系成員，減輕社會(huì)負(fù)擔(dān)。雖然現(xiàn)在眾多學(xué)者已對該病做了大量的研究，但目前殘毀性掌跖角皮癥的致病基因及發(fā)病機(jī)制仍不十分清楚，依舊處于探索階段，由于該病比較罕見，在積極總結(jié)前人研究成果的基礎(chǔ)上，我們要繼續(xù)收集患者家系，并對其進(jìn)行基因檢測，豐富遺傳資源。另一方面從基因功能研究上探索該病的發(fā)病機(jī)制，為今后對該病的診斷及治療打下堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。4結(jié)論(1)GJB2基因中D66H錯(cuò)義突變?yōu)楸炯蚁档闹虏』颉?2)在GJB2基因中D66H錯(cuò)義突變是中國漢族人群中典型殘毀性掌跖角皮癥的致病原因之一。 山東大學(xué)碩十學(xué)位論文參考文獻(xiàn)[1]張學(xué)軍，陳建軍等．中國皮膚遺傳病研究現(xiàn)狀．中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，27(3)：408—414．[2]趙辯．臨床皮膚病學(xué)[M]．第4版．南京：江蘇科學(xué)技術(shù)出版社，2010，1074一1080．【3】Bolognia幾，Jorizzo兒，R印iniRP．Keratodema．De肌atolo夥seconded2008，p．783．【4】ReisA，HenIli鷦HC，LallgbeinL，eta1．Keratin9genemmationsinepidennol舀icpalmoplantakeratod鋤la(EPPK)．NatGeIlet，1994，6(2)：174．179．【5】HanPS，ZhangYFiratIiE，eta1．Id鉍ti6cationofcam印sinC枷tationsiIl甜lIlicallydiVerSePapillon—LefeVresyndr01nepatients．JMedG鋤et，2000，37(12)：927-932．【6】VohwiIll【elKH．Keratomahercdit撕啪mutilans．刪lDe肌atolS)，philol，1929，158：354．364．[7】Wi91eyJEM．Acaseofhyperkeratosispalm撕setplant撕sassociatedwimaillllum-likeconstriCtionoftllefinge魏BrJD鋤a_tol，1929，4l：188—191．[8]楊建強(qiáng)，王培光，楊森，等．VohWinkel殘毀性掌跖角皮癥[J]．臨床皮膚科雜志，2010，39(3)：167—168．[9】BondesonML，Nysn為mAM，GunnarssonU，eta1．Co衄eXiIl26(GJB2)mutationsint、】l，oSwedishpatieI】曬wiⅡlatypicalVrohwir出el(mutilatingkcratod鋤apluSdea缸ess)粕dⅪDsyndromeboⅡlexteIlsiVely仃eatcdwimaci仃etin[J】．ActaDeml、，髓蝴l，2006；86(6)：503·508．【l0】LeeSW，TomasettoC，PaulD，eta1．TraIls函ptioIlald0眥egulationofgap-j11Ilctionprote幽blocl(sjun“onalcommuIlicationi11hum觚m猢a巧nⅡnorceUlines[J】．CeHBiol，1992；118：1213-1221．[11】Mi印onC，F(xiàn)romagetC，MatteiMGeta1．Assi黟llllentofc0IlIleXin26(GJB2)鋤d46(GJA3)geIlestohum觚chromosomel3q1l·q12鋤dmouSeChromosome14D1-E1byinsinJhybddization【J】．Cytogcllet．CenGeIlet，1996；72：185．186．[12】HohlD，MehrelT，LichtiU，eta1．Charact甜zationofhumanIori謝n：s協(xié)】ctIlrc 山東人學(xué)碩上學(xué)位論文andFunc虹onofanewcl弱sof印ide咖alcellenVelopep∞teiIlS．[J】．Bi01．Ch鋤，1991；266：6626．6636．【13】YonedatKHolllD，McBrideO，eta1．neh【maIlloricmgeIle忉．Bi01．Chem，1992；267：18060-18066．[14】KelsellDP，DuIlIopJ，StevellsHP，eta1．C0衄e洳26mutationsiIlh刪itarynon-sylldromicsellso血euraldea舭ss[J】．Nature1997；387：80—83．[15】MaestrilliE，MonacoAP，McGramJA，eta1．Amotcculardef；烈iIllori嘶n，mem旬orcompon％t“t王leconli矗ed捌lenVelope，ulld鰣iesVoh州lll(el’ss)，Ildrome．NatllrcGenetl996；13：70-77．【16】心ms乜-ongDKB，McKerulaKE，Hu曲esAE．AnoVcIinsertionalmutationinlori嘶ninVohwiIll【el’skeratodenlla．JhlvestD鋤latol，1998；111：702—704．【17】Ishida-Y抽鋤ot0A，McGr砒J八L鋤H，eta1．Themolecularpathologyofprog聲essiVesyInmetric戧yⅡl：rokeratod蹦na：af．rameshiftmmationiIltheloricriIlg搿leandpe咖rbatiollsinnlecomifiedcellellvelope．AmJHunGellct，l997，6l：58l一589．[18】MaestriIliE，KorgeBP，0c碰a-Sie盯aJ，eta1．AmisseIlsemutationinco皿exiIl26，D66H，causesmutilatingkeratode衄awimse芏180fineur2Lldea伍essmhwinkeI’ss)，lldrome)int11reelmreIatedfamilics．H哪MoIGenet，1999，8(7)：1237—1243．【19】Snoecl()【RL，Hass鋤DM，＆曲棚NM，吼a1．Mutationa11alysisofnleGJB2(C0衄eXin26)geneiIlEgypt．H啪Mutat，2005，26(1)：60·61．【20】BondesonML，Ny咖啪AM，GullIlarSsonU，eta1．Collll懿in26(GJB2)mutationsin鉚oSwedishpatientswimatypical、bhwiI呔cl(舢tilatingkeratod黜1aplusde疵ess)andⅪDsyn抓’mebomext鉍SiVely垃eatedwit圭lacitretin．ActaDe蕊Vmerc01，2006；86(6)：503—508．【21】deZwan—Sto珊EA，V觚GeelM，veySeyE，eta1．AnovelmissensenmtationinGJB2，p．1'yr65His，causesscvere、7．ohwinkelsyndrome．BrJDefmat01，20ll，164(1)：197一199．[22】GorlinRJ，Sed撇0H，AndcrsonⅦ．Thes弘1dromeofpalm唧l觚tarlIyperkeratosis鋤dprema：tureperiodontaldestmctionofmetee吐1．Aelimcal鋤dgeIletic鋤alysisofmePapillon．LefeⅥesyndrome．JPedia饑1964，65：895—908．[23】B撕sHN，Zlotogorsl(iA，Peretz-Amitqeta1．An0VelGJB6missense30 山東大學(xué)碩士學(xué)位論文mutationinllidroticectodermaldySpl嬲ia(Clollstonsyndrome)broadellSitsgeIlotypicb鶴is．BrJD鋤atol2008；159(6)：1373一1376．[24]許素玲，烏日娜，陸建猛，等。殘毀性掌跖角化病伴頭發(fā)生長障礙一例。中華皮膚科雜志。2002，35(2)：159．【25】BeIlM，HoedeN，SchopfRE．Pseudo-aillll啪iIlvohwinkeldiseaSe．K鋤tomah∞edit撕眥mutila璐．Hautarzl，1993，44：738·741．【26】J鋤esWD，B嘴erTGElstonDM．AndrewsDiseasesOfneSkinCliIlicalD鋤atology．Palmopl鋤tarKeratIDd伽=Ila2006．p．2l3—2l4．[27】BumsT，BreaⅡmachS，CoxN，Gri伍msc．DisordersofKeratinization．R00k’s1'eXtb00kofDematolo黟sev鋤tlled2004．p．80·99．【28】OlmstedHC．Keratode珊iapalIIl撕setplallt撕scong觚talis．AmJDisCllild，1927，33：757—764．【29】C鋤isaC，Ross觚aC．Ⅷantofkeratodenmherodit撕amutil姐s(Vohwilll(el’ssyndrome)．觚hD鋤acol，1984；l20：l323—1328．【30】11raupeH．Autosomaldominantcong鉍italidlthyosis鋤dk黜肋de眥ahercdit撕amutilallsofVohwiIll【el’siIl：111eIchnlyoses．AGuidetoCliIlicalDiagnosis，GeIleticCouIlselingandTherapy．B甜inHeidelbe昭：Spring昏、研l(wèi)a島1989；2ll-212．【31】B越rtzisGChoudh巧R，A嬲eIlT’eta1．Targeted印ide髓aleXpressionofmut觚tCo衄exill26(D66H)mimics仃ueVrohwilll(clsyndrolnea11dp∞videsamodel矗玎mepa廿109朗esisofdominantc0皿exindisorde娼．HumMolGcIlet，2003，12(14)：1737-1744．【32】P嘶skS小atiEF'TorloneQeta1．陸atodennaheredit撕um舢tila璐(Ⅶhwinkel’ss弘ldrome)嬲sociatedwimcongenitaldeafmutism．BrJD鋤at01．1995Apr；132(4)：617—20．【33】SinhaM，WatsonSB．Keratodemlaheredit撕ummutilaIls(Vollwilll【els)，Il(1rome)．JHandSu瑪Eur、b1．2009Apr，34(2)：235-7．[34】Bass鰣oF，TieIl90C，Sf-errazzaR，V0hwiI婦lsyndrome：仃eatIIl饑tofpseudo·ainh啪．IntJD鋤at01．2010JaIl；49(1)：79—82．[35]蔣建華，殘毀性掌跖角皮癥l例。實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志。2007，23(16)：2469．31 山東大學(xué)碩士學(xué)位論文論文綜述殘毀性掌跖角皮癥致病基因的相關(guān)研究進(jìn)展【摘要】殘毀性掌跖角皮癥(MutilantingPalmoplantarKeratoderma)是一種非常少見的常染色體顯性遺傳性疾病。目前很多學(xué)者雖已對該病進(jìn)行了大量研究，但其發(fā)病機(jī)制仍未明確。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，已發(fā)現(xiàn)兩個(gè)與該病有關(guān)的致病基因，一為編碼縫隙連接蛋白的GJB2基因，另一個(gè)是編碼兜甲蛋白的oLOR基因，包含GJB2基因和LoR基因突變的轉(zhuǎn)基因鼠模型己復(fù)制成功，為該病發(fā)病機(jī)制的探討提供依據(jù)。本文對該病致病基因的相關(guān)研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述。【關(guān)鍵詞】殘毀性掌跖角皮癥GJB2基因LOR基因【正文】1殘毀性掌跖角化病殘毀性掌跖角化病(MutilantingPalmoplantarKeratoderlIla)又被稱為沃溫克耳綜合癥(Vohwinkelsyndrome，VS，0MIM124500)。于1929年由德國學(xué)者VohwinkelⅢ和Wi91ey跚分別獨(dú)立描述并命名，它是一種罕見的常染色體顯性遺．傳病，多呈家族性發(fā)病，同時(shí)也有散發(fā)病例的報(bào)道。該病好發(fā)于白種人女性，多于嬰幼兒起病，病程呈進(jìn)行性發(fā)展。其典型的臨床表現(xiàn)包括：對稱性彌漫性掌跖角化，掌跖表面呈蜂窩狀小凹餡；手足背部及肘膝關(guān)節(jié)等處可呈典型的海星狀或條狀角化過度斑塊；指趾遠(yuǎn)端環(huán)形縮窄并逐漸斷離(呈假阿洪病樣改變)。X線檢查可見：掌趾、跖趾骨質(zhì)脫鈣，遠(yuǎn)端指(趾)骨吸收，營養(yǎng)性的骨萎縮。皮膚病理改變：表皮高度角化過度，顆粒層與棘層增厚。真皮淺層血管周圍可見炎細(xì)胞浸潤。臨床可伴有不同程度的感音神經(jīng)性耳聾，先天性魚鱗病，禿發(fā)，白癜風(fēng)，癲癇等口，鍆。如果殘毀性掌跖角皮癥合并腔口部位的角化過度性增生，則被稱為01mstedSyndrome啼3。該病也屬于常染色體顯性遺傳性疾病，可伴發(fā)脫發(fā)及關(guān)節(jié)異常。本病呈慢性進(jìn)行性病程，無特效治療方法，口服維A酸類及外科手術(shù)治療有32 山東大學(xué)碩+學(xué)位論文一定療效田J1，但遠(yuǎn)期療效不佳，易復(fù)發(fā)。本病的發(fā)病機(jī)制尚未明確，隨著分子遺傳學(xué)的發(fā)展，許多學(xué)者對該病的致病基因及其功能做了大量的研究，目前已定位克隆鑒定出兩個(gè)與殘毀性掌跖角化病有關(guān)的致病基因：分別是定位在13號(hào)染色體13q¨。12上編碼縫隙連接蛋白Cx26的GJB2基因和定位在l號(hào)染色體1q21上編碼兜甲蛋白的LOR基因。由GJB2基因突變導(dǎo)致的殘毀性掌跖角化病常伴有聽力異常，被稱為典型的殘毀性掌跖角化病伊刪；由LOR基因突變導(dǎo)致的殘毀性掌跖角化病常伴有魚鱗病，被稱為變異型殘毀性掌跖角化病m，刪。也有報(bào)道聽力損害和魚鱗病發(fā)生在同一殘毀性掌跖角化病的病例以及均未伴有的家系中n羽。2殘毀性掌跖角皮癥與GJB2基因GJB2基因在1992年被克隆出并定位于染色體13qll—q12上，該基因全長4804bp，編碼區(qū)為678bp，含2個(gè)外顯子，但編碼區(qū)僅位于下游外顯子上，編碼含有226個(gè)氨基酸縫隙連接蛋白26(Cx26)，因此很容易通過PCR擴(kuò)增并測序分析。Cx26是縫隙連接大家族中的一員，屬于B一2型縫隙連接蛋白?？p隙連接蛋白(co肌exin，Cx)是縫隙連接的物質(zhì)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，參與細(xì)胞間信息傳遞、物質(zhì)運(yùn)輸及生長調(diào)控等，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，它與腫瘤的發(fā)生關(guān)系密切。縫隙連接存在于幾乎所有類型的細(xì)胞表面，為電突觸的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，它是相鄰細(xì)胞膜間信細(xì)傳遞的通道，只允許細(xì)胞間離子及小于1KD的代謝小分子物質(zhì)通過。當(dāng)細(xì)胞接受刺激后，細(xì)胞膜內(nèi)外電勢改變，縫隙連接通道開放，將離子及其它調(diào)節(jié)物質(zhì)(如第二信使)傳遞給相鄰細(xì)胞，使之產(chǎn)生相應(yīng)反應(yīng)。每個(gè)縫隙連接由相鄰細(xì)胞間包膜上的連接子(connexon)錨定形成，每個(gè)連接子又有六個(gè)相同或不同的縫隙連接蛋白組成，它可以調(diào)節(jié)通道的開閉，從而選擇性讓小分子物質(zhì)通過。迄今為止，在縫隙連接蛋白大家族中至少發(fā)現(xiàn)了20多個(gè)成員，分子量均在26～56KD之間，分為Q—Cx和B—Cx。連接蛋白有著共同的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)：四次跨莫將其分為五個(gè)區(qū)，即N端、C端區(qū)，跨膜區(qū)(TM卜4)，細(xì)胞外區(qū)(E1和E2)，細(xì)胞內(nèi)區(qū)(CL)。N端與TMl之間的胞內(nèi)區(qū)構(gòu)成電壓感受器的電荷復(fù)合體，E1與E2區(qū)決定連接蛋白之間的相容性，CL和C端區(qū)與間隙連接通道的PH門控有關(guān)。連接蛋白基因突變可產(chǎn)生無功能或功能缺陷的連接蛋白，使縫隙連接缺損，通道開閉異常，從而導(dǎo)致細(xì)胞間信息傳遞受阻或紊亂。33 山東人學(xué)碩士學(xué)位論文1997年Kelsel等n釘對一同時(shí)患有遺傳性掌跖角化病伴深度感音神經(jīng)性耳聾的家系進(jìn)行致病基因檢測時(shí)發(fā)現(xiàn)所有患者GJB2基因均發(fā)生了一個(gè)雜合錯(cuò)義突變101T—C，使Cx26N一末端區(qū)域第34位氨基酸，導(dǎo)致甘氨酸(G1y)被精氨酸(Arg)替代，即M34T突變。1997年人們發(fā)現(xiàn)GJB2基因與遺傳性非綜合征性耳聾(NSHI)關(guān)系密切相關(guān)，而且經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)235delC是該病最常見的突變類型。經(jīng)免疫組化證實(shí)，在聲音傳導(dǎo)過程中內(nèi)耳非感覺上皮細(xì)胞和組織細(xì)胞表達(dá)的Cx26蛋白，對K+經(jīng)內(nèi)耳毛細(xì)胞循環(huán)回流進(jìn)入耳蝸內(nèi)淋巴液起調(diào)控作用。GJB2基因突變后導(dǎo)致K+進(jìn)入內(nèi)淋巴液受阻，從而導(dǎo)致感音神經(jīng)性耳聾。1999年，Maestrini等陽1對三個(gè)來自不同國家(英國、西班牙和意大利)的殘毀性掌跖角化病伴感音神經(jīng)性耳聾家系進(jìn)行研究時(shí)，通過連鎖分析首次將本病的致病基因定位在13號(hào)染色體q11一q12上，在對GJB2基因進(jìn)行基因序列分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，在三個(gè)毫無關(guān)系的家系中所有患者的GJB2基因均存在一個(gè)雜合錯(cuò)義突變196G—C，導(dǎo)致第一細(xì)胞外區(qū)域第66位天冬氨酸被組氨酸替代(即D66H突變)，而家系中所有正常人的GJB2基因測序結(jié)果均未發(fā)現(xiàn)此突變。此結(jié)果說明D66H是殘毀性掌趾角皮癥伴感音神經(jīng)性耳聾的致病基因，導(dǎo)致Cx26分子的第1個(gè)細(xì)胞外區(qū)的1個(gè)高度保守的殘基發(fā)生改變，進(jìn)而干擾連接小體的組裝，以及Cx分子錨定于鄰近細(xì)胞和在縫隙連接中所起的門控功能。進(jìn)一步研究表明所有患者均為攜帶該突變基因的雜合子個(gè)體，由此作者證實(shí)該突變?yōu)槌Ｈ旧w顯性遺傳性聾的病因之一。2005年，RikkertL．Snoeckx等n目在分析埃及耳聾患者中GJB2基因突變時(shí)，其中有一個(gè)伴有Vohwinkel綜合癥的家系，患者為父子兩人，均有彌漫性掌跖角化伴深度感音神經(jīng)性耳聾，父親右足的第2，3趾有纖維性縮窄環(huán)，即假一阿洪病樣表現(xiàn)。在對該家系進(jìn)行GJB2基因序列分析時(shí)發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的突變位點(diǎn)p．Glyl30Val(G130V)，此點(diǎn)是位于GJB2基因高保守區(qū)域的一個(gè)顯性突變。該家系正常人中未發(fā)現(xiàn)此突變。據(jù)說GJB2基因的顯性突變導(dǎo)致聽力異常和皮膚病可有不同程度外顯率n即，所以該家系中兒子未有典型的假阿洪病樣表現(xiàn)。在VS致病基因中，G130V是唯一位于GJB2基因的第二細(xì)胞外區(qū)域的突變位點(diǎn)。Marie—LouiseBondeson等‘133于2006年對瑞典一vs患者做GJB2基因突變檢測時(shí)發(fā)現(xiàn)另一個(gè)新的突變位點(diǎn)p．Gly59Ser(G59S)，患者為一60歲的老年男性，掌 山東大學(xué)碩上學(xué)位論文跖彌漫性角化過度增生，呈蜂窩狀小凹，指趾可見假阿洪病樣改變，同時(shí)伴有先天性聾啞和泛發(fā)全身的魚鱗病。突變點(diǎn)位于GJB2基因的第一個(gè)高度保守序列的非保守突變。該患者父母早逝，無子女，G59S為一新發(fā)突變，并最終發(fā)展為基底細(xì)胞癌和鱗狀細(xì)胞癌。2011年，deZWart—Stormn刀等，發(fā)現(xiàn)了第四個(gè)引起殘毀性掌趾角皮病的突變位點(diǎn)，p．Tyr65His(Y65H)，該位點(diǎn)與1999年Maestrini等發(fā)現(xiàn)的突變位點(diǎn)(D66H)緊緊相鄰，相鄰的兩個(gè)密碼子突變引起相同的臨床表型，這在GJB2基因上還是第一次見到。至今，在GJB2基因上共發(fā)現(xiàn)以上4種突變類型與典型殘毀性掌跖角皮癥有關(guān)，均為單一堿基雜合錯(cuò)義突變，說明部分氨基酸殘基在該病的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。有研究報(bào)道，D66H和Y65H突變形成的突變型Cx26在細(xì)胞中分布和結(jié)構(gòu)異常，導(dǎo)致其形成的縫隙連接通道功能障礙，采用細(xì)胞熒光免疫示蹤法(parachuteassay)檢測到由突變型Cx26構(gòu)成的連接通道對染料的轉(zhuǎn)移較野生型Cx26明顯減少∞·”，181。GJB2基因突變是引起常染色體隱性遺傳性非綜合征性耳聾(NHSI)的主要原因，大約一半以上是由該基因突變導(dǎo)致。目前已作為兒童先天性耳聾的常規(guī)篩查基因[15]。由GJB2基因突變導(dǎo)致殘毀性掌跖角皮癥患者也均伴有聽力異常，而兜甲蛋白基因突變無聽力障礙，但常伴有魚鱗病。3殘毀性掌跖角皮癥與LOR基因LOR基因定位于1q21上，其DNA全長為1206bp，編碼316個(gè)氨基酸的兜甲蛋白。兜甲蛋白是組成角化細(xì)胞膜的其中一個(gè)蛋白，變異的兜甲蛋白可以在細(xì)胞核內(nèi)積累并最終干擾角化細(xì)胞終末分化的凋亡過程n螂1。1996年，Maestrini等n們對美國一殘毀性掌跖角化病伴魚鱗病的大家系進(jìn)行研究時(shí)，通過連鎖分析將該家系致病基因定位在1q2l上，在對LOR基因序列分析時(shí)發(fā)現(xiàn)第730位插入一個(gè)堿基G，從而改變了C末端富含甘氨酸一谷氨酸一賴氨酸的翻譯結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致角化破壞。1997年，Korge等＆蛆對德國兩個(gè)不同臨床表現(xiàn)的家系進(jìn)行分子學(xué)研究，一個(gè)伴有魚鱗病，另一個(gè)伴有耳聾。同樣在伴有魚鱗病的殘毀性掌跖角皮癥家系中發(fā)現(xiàn)730insG突變，證明了兜甲蛋白突變僅見于伴有魚鱗病的VS患者中。同時(shí)也35 山東大學(xué)碩上學(xué)位論文驗(yàn)證了兩者在臨床和超微結(jié)構(gòu)上有很大的不同。1998年，A瑚strong等蚴，對北愛爾蘭一伴有魚鱗病的VS家系分析發(fā)現(xiàn)在LOR基因上第209個(gè)密碼子處有單一堿基T插入(662insT)。使終止密碼延遲，導(dǎo)致107個(gè)氨基酸移碼突變并新增22個(gè)氨基酸。1999年，Takahashi等幢31對日本一VS伴有泛發(fā)的魚鱗病同時(shí)伴有感音性耳聾的患者進(jìn)行研究，患者是一名20歲青年女性，家族中無類似病史，該患者無典型的海星狀角化損害，在對該患者10ricrin基因進(jìn)行序列分析時(shí)發(fā)現(xiàn)第231位密碼子插入一個(gè)G(即730insG突變)，導(dǎo)致移碼突變和異常的C末端。伴有魚鱗病的殘毀性掌跖角皮癥較伴有聽力異常的更為少見，至今，國內(nèi)外共發(fā)現(xiàn)8個(gè)患該病的家系，3種突變類型，分別是：730insG，662insT和709insCn吼％捌，均為單一堿基插入突變。8個(gè)家系中有6個(gè)家系的突變方式為730insG，可見在LOR基因上730insG是導(dǎo)致該病的熱點(diǎn)突變。730insG突變導(dǎo)致移碼突變和異常的C末端，改變了C末端84個(gè)氨基酸并且比野生型兜甲蛋白增加了22個(gè)氨基酸，致使富含谷氨酸／賴氨酸的序列改變?yōu)楦缓彼幔涟彼嵝蛄?，此結(jié)果同樣出現(xiàn)在4個(gè)不同的國家(英國、日本、蘇格蘭、德國)中，說明在不同的種群中存在相同的突變熱點(diǎn)。在僅有耳聾的vs家系中未發(fā)現(xiàn)該突變，說明此突變僅存在于伴魚鱗病的VS家系中。2000年，Suga等阱1在鼠的Loricrin基因編碼序列的1190核苷酸的位置上插入一個(gè)堿基C，成功制造了Loricrin轉(zhuǎn)基因鼠的模型，轉(zhuǎn)基因鼠的皮膚表現(xiàn)類似于殘毀性掌跖角皮癥伴有魚鱗病的病人的臨床表現(xiàn)，同時(shí)也證明了鼠變異兜甲蛋白的羥基端含有一個(gè)核定位序列(NLSs)，他們把敲掉的Loricrin基因鼠與轉(zhuǎn)基因鼠交配，證實(shí)可有更為嚴(yán)重的表型。4問題與展望縫隙連接蛋白26(Cx26)的基因突變在皮膚疾病及聽力異常中的作用尚未完全清楚。其基本的分子機(jī)制可能為：GJB2基因突導(dǎo)致縫隙連接蛋白26結(jié)構(gòu)及其在細(xì)胞中的分布異常，從而導(dǎo)致縫隙連接通道障礙，進(jìn)而影響細(xì)胞間小分子物質(zhì)的傳遞及信號(hào)的傳導(dǎo)。由于變異型殘毀性掌跖角皮癥更為罕見，臨床病例較少，以至于給該病的基礎(chǔ)研究帶來一定的困難，而且該病的臨床表型與基因型的關(guān)系也不易得到。各患 山東大學(xué)碩j￡學(xué)位論文者家系中不同的臨床表現(xiàn)可能是該病表型的連續(xù)，因而引出了存在其它相關(guān)基因的假設(shè)：LOR基因的多態(tài)性或存在不同的修飾基因，從而導(dǎo)致了變異型殘毀性掌跖角皮癥的臨床表型多樣化并影響了其發(fā)病機(jī)制。雖然現(xiàn)在眾多學(xué)者已對該病做了大量的研究，但目前殘毀性掌跖角皮癥的致病基因及發(fā)病機(jī)制仍不十分清楚，依舊處于探索階段，由于該病比較罕見，在積極總結(jié)前人研究成果的基礎(chǔ)上，我們要繼續(xù)收集患者家系，并對其進(jìn)行基因檢測，豐富遺傳資源。另一方面從基因功能研究上探索該病的發(fā)病機(jī)制，為今后對該病的診斷及治療打下堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。參考文獻(xiàn)【l】Vohwilll(elKH．斯atomaheredit撕啪mutil鋤s[J】．ArchD鋤atolSyp惋lol，1929，158：354_364．[2】WiglcyJEM．Acaseofhyperk蹦肋sispaJm撕setplallt撕sassociatedwimaillll啪-likeconstrictionofⅡlefingers．BrJDenna協(xié)l，1929，4l：188·191．[3]馮蘭珍，徐素芹，梁祖棋，等。毀性掌跖角皮癥伴白癜風(fēng)1例[J]。中國皮膚性病學(xué)雜志，2004，18(4)：242—243．[4】Sen．觚oC嬲仃oPJ，Nar刪oF鋤鋤dezC，QuirogaSubiranaP’eta1．VohwiIlkelSyndromeseconda巧t0misseIlseInutationD66HiIlGJB2g吼e(co蛐％ill26)c鋤include印il印ticmaIlifestatio璐．Seizllre'2010，19(2)：129-131．[5]馬東來，胡瑾，方凱。Olmsted綜合癥國內(nèi)首報(bào)[J]。臨床皮膚科雜志，2006，35(10)：637—639．[6】SiVay砒omA，Ton印al【S．MutilatingKeratodenIlaofVohwilll(el：success列訛她entwimen娥ina_te．JMedAssoc111ai，1985，68(10)：546—551．【7】Basse№F'Tien90C，Sf．e玎azzaR，cta1．Voh麗Ill【els”drome：骶a缸nentofps印do·aillll啪．IntJDemat01．20lO，49(1)：79—82．【8】硒dl莉GRo啪F’WilloughbyCE，eta1．Miss％semutationsinGJB2饑codingco衄exin-26cauSeⅡleectodenIlaldysplasiakeratitis·ichthyosis—dea血esssyndI。ome．Am．J．Hum．G肌ct，2002，70：134l-l348．【9】MaestriniE，Ko唱eBP，Oc蚯a—Sien．a(chǎn)J，eta1．AIIliss吼semutationinCoIlIlexiIl26，D66H，causesmutilatingkeratode加awimsellso血euraldea伍eSs(Vohwinkel’s37 山東大學(xué)碩十學(xué)位論文syn出ome)inthree硼樹ated‰ilies．H啪MolGellet’1999，8(7)：1237-1243．【10】M砌iIlS，G齟abedianEN，RogerG融a1．ConnIexin一26靜lemmationsillcong饑itallydeafctlildr饑：pitfalls南rgelleticcounseling．知．cllOtolaryll90lHeadNeckSu唱，200l，127：927—933．[11】Mats啪ot0KMutoM，Sel(iS，eta1．Lori砸nkeratodenna：acauSeofcong饑italichmyosi硒merythrodema觚dcollodionbabyBritishJo啪alofDcn[Ilatology，200l，145：657—660．【12】O’DrisconJ，MustonGC，Mc(衲mJA，eta1．AfecIlrr曲tmutationinⅡ1elori醯lg鼢e11Ild訓(xùn)iestlleichmyoticVari鋤tofⅦhwill王【el，Ssyndrome．ClinExpD鋤atol，2002，27：243—246．【13】BondesonML，Nys拍mAM，GullllarssonU，e￡a1．Cofulexin26(GJB2)mutationsi11鉚oSwedishp撕e11tswitllatypicalⅦh、析11l【el(mutilatingk鋤todennaplllsdea向ess)andKIDsyndmmebomextcIlsiVely骶atedwitllaci眈tin．ActaDenllVe：Ilereol，2006；86(6)：503-508．【14】KelsellDP，Dulll叩J，SteValSHP'eta1．C0硼exiIl26mutationsinh硼itarynon—s)r11dr0IIlicsensorineuraldea魚ess【J】．N曲叮．e1997；387：80·83．【15】Snoecl【xRL’Hass孤DM，k吼alNM，eta1．Mutation觚alysisoft11eGJB2(c0衄exiIl26)geneinEgypt．HumMutat，2005，26(1)：60-61．．【16】KelsellDP，DiWL，HolIs鋤a|lMJ．CollIlcXillmutationsinsl【indise嬲e鋤dhearingloss．加nJHumG饑嘰2001，68：559—68．[17】dezwan—Sto衄EA，VaIlGeelM，vcyseyE，eta1．AnoveImisseIlsemutationiIlGJB2，p．Tyr65His，causessevere％h耐Ill(els”drome．BrJDemacol，201l，164(1)：197-199．【18】Bal【i】舵isGChoudll巧＆Aas髓T'eta1．Targetcd印ide徹面eXpressionofmutaIltConnexill26(D66H)mimicS饑璩vohwinkelsylldromeaIldprovidesamodelfor也epathogenesisofdominantco衄cXindisorders．H啪MolGeIlet’2003，12(14)：1737·1744．【19】MaestrilliE，Monac0AP，Mc(南ramJA，eta1．Amoleculardefectinloricrin，廿1em旬orcompon饑tofⅡleconli6edcellenVelope，und酬i鎬vohwillkel’ssyIldrome．N砷毗．eG饑et，l996，l3：70一77．3R 山東大學(xué)碩士學(xué)位論文【20】DreraB，TadiIliqBalboF，eta1．Denov0occ咐eIlceofme730insGrecu玎％tmutationill觚Itali齜觚ilywiⅡlmeichmyoticV撕alltofVoh謝lll(e1syndrome，loric血keratode眥a．ClinG鋤et，2008，73(1)：85—88．【21】KoFgeBP，Ishida—Y細(xì)鋤ot0A，PurltcrC，et．a(chǎn)1．LoricrinmutationiIlVohwilll【d’skeratod鋤aisu11iquetonleV撕a11twinlichnlyosis．JhlVestDcnIlatol，1997．109：604—610．【22】知msn．ongDKB，McKellIlaKE，Hu曲髂AE．Anovclins哪ionalmutationin10riQrinill、廠ohwiIlkel’skeratode衄a．JInvestDenIlatol，l998，11l：702-704．【23】Isllida-Y．黝鋤ot0A，McGranlJA，L鋤H，eta1．Them01ecularpathologyofpro國舊ssivesyl如【n矧cerytlll．0keratodenna：a仔鋤eshiRmutationiIlmeloricringene觚dpeftmationsintlleconlifiedcdl饑、，elope．AmJH啪Gellet，1997，61：581-589．【24】SugaYJanlikM，AttarPS，eta1．TraIlsgellicmiceeXpressingamutantfonnoflo打耐nrcvcaltllemolccularbasis0fmeskiIldise豁鼯，、，0h、斬nkelsyndromeandpI．09ressiVesymnletricerytlⅡokeratodenna．JCellBiol，2000，151：40l一412．39 山東大學(xué)碩上學(xué)位論文致謝呈現(xiàn)這篇論文的同時(shí)，亦奉上我最真誠的謝意和敬意!今天，我首先要衷心感謝我的導(dǎo)師張莉教授!感謝張老師在我三年研究生學(xué)習(xí)生涯中給予我的關(guān)心、教誨和愛護(hù)!張老師博大的胸懷、淵博的知識(shí)、謙遜的人品、精湛的技術(shù)、雷厲風(fēng)行的工作魄力及富有創(chuàng)造力的思維方式，使我耳濡目染，受益終生。在此即將畢業(yè)之際，向張老師三年來對我在學(xué)業(yè)上的悉心指導(dǎo)和生活上的關(guān)懷幫助表示由衷的敬意和誠摯的謝意。同時(shí)，我也要真誠感謝皮膚科戴文麗教授、張樹孝教授、王承顧教授、劉洪義教授、萬俊曾教授、于志湖教授、任忠芬副教授、孫志堅(jiān)教授、周淑華教授、楊安波教授、魏欣凈教授、金德蕙副教授、王紅副教授、李頌副教授及科室其他老師們?nèi)陙聿痪氲慕陶d，他們正直的人品，高尚的醫(yī)德，對事業(yè)鍥而不舍的追求精神是我畢生學(xué)習(xí)的楷模!非常感謝皮膚科實(shí)驗(yàn)室陳瑞娥、路麒、施巖老師三年來對我學(xué)習(xí)及生活上的幫助，他們認(rèn)真的工作態(tài)度、樂于助人的精神使我深受感動(dòng)，在此表示誠摯的感謝!真誠感謝師兄弟姐妹王震英、宋亞麗、李圓圓、郭亞楠、陳楠、陳臘梅、聶小娟、劉雯敏、孟憲敏、溫廣東、宋秀風(fēng)、張本利、張杰、郭小璇、姬燦燦等在學(xué)習(xí)和生活上給予的熱情幫助，難以忘懷和他們共同拼搏的日子，他們讓我感受到了真誠的友誼和溫暖，我將永遠(yuǎn)銘記這段不平凡的歲月。特別感謝所有提供血樣及家系資料的家系成員，謝謝你們的無私奉獻(xiàn)!最后，深深感謝我的父母、家人、朋友多年來對我無微不至的關(guān)懷和呵護(hù)，是你們的理解、愛護(hù)和支持給了我晴朗的天空和前進(jìn)的力量!謝謝你們! 山東人學(xué)碩士學(xué)位論文攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄1．王占想，陳楠，宋亞麗，等．一殘毀性掌跖角化病家系致病基因突變研究．中華皮膚科雜志，2012，45(5)：344—346．第一作者2．王占想，宋亞麗，陳楠，等。一有汗性外胚葉發(fā)育不良家系致病基因突變篩查．中國麻風(fēng)皮膚病雜志，2012，28(6)：第一作者3．QiuYing，WangZhanxiang，ChenNan，eta1．D66HmutationinGJB2geneinaChinesefamilywithclassicalVohwinkelsyndrome．IndianJDermat01VE．已接收，并列第一作者4．山東地區(qū)銀屑病患者CYP3A5基因多態(tài)性分析及其與環(huán)孢素A療效、毒副作用的關(guān)系。第一作者，待發(fā)表。5．金德蕙，宋亞麗，王占想。山東地區(qū)銀屑病患者亞甲基四氫葉酸還原酶基C677T多態(tài)性檢測及其與MTX療效、毒副作用的關(guān)系。中國麻風(fēng)皮膚病雜志，2012，28(8)：已接收，第三作者4l 學(xué)位論文評閱及答辯情況表專業(yè)技術(shù)是否博導(dǎo)總體評姓名所在單位職務(wù)(碩導(dǎo))價(jià)※論田搏尚擻瞧、鑼曲枘燃飄翩叩綺征|~又評鄖凍違教．襲舡止東怨確酗萏閱人專業(yè)技術(shù)是否博導(dǎo)所在單位姓名職務(wù)(碩導(dǎo))主席王玉磷教授足山東夫?qū)W膏留醫(yī)陶琴像芝教娩爰幽東犬勛隧匠陬答辯舊僻南蘇縋旯燃劃蝴隔繃翻’、‘—一委員委凰溯燃磊幽加噬韶舷陶會(huì)麟墼敦艇西從床黼翩組翻成員答辯委員會(huì)對論琳?答辯日文的總體評價(jià)※噬答辯秘書鉻弛．期弘f≯．j．必備注※優(yōu)秀為“A，’；良好為“B”；合格為“C”；不合格為“D”．