兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島細(xì)胞分化的研究

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1、河南農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島細(xì)胞分化的研究姓名：何俊丹申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：臨床獸醫(yī)學(xué)指導(dǎo)教師：王新莊201205河南農(nóng)業(yè)大學(xué)2012屆碩士畢業(yè)論文兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島細(xì)胞分化的研究摘要骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bonemarrowmesenchymalstemcells，蹦SCs)是一類具有多向分化潛能的干細(xì)胞，有望成為未來細(xì)胞、基因治療、組織工程技術(shù)的理想種子細(xì)胞。本研究目的在于分離純化兔BMSCs，并研究其在體外分化為胰島細(xì)胞的潛能，以便未來利用該類細(xì)胞作為疾病細(xì)胞和基因治療的模型。為此，本試驗(yàn)利用一月齡新西蘭大白兔為研究對(duì)象，較為系統(tǒng)全面地研究了其BMSC

2、s的分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增、鑒定、形態(tài)學(xué)及體外誘導(dǎo)分化能力，為進(jìn)一步深入研究BMSCs的誘導(dǎo)分化和應(yīng)用打下試驗(yàn)基礎(chǔ)。1．應(yīng)用全骨髓法分離BMSCs，根據(jù)骨BMSCs在培養(yǎng)瓶中貼壁生長的特點(diǎn)，通過傳代培養(yǎng)來純化已分離到的BMSCs，體外培養(yǎng)至第3代，獲得純度較高的BMSCs；對(duì)分離純化的第3代兔BMSCs進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和細(xì)胞表面特異性標(biāo)志物鑒定，得出兔BMSCs表面標(biāo)志CD90、CD44陽性表達(dá)，CD34陰性，進(jìn)一步證實(shí)了本法所得到的純化細(xì)胞即為兔BMSCs，為進(jìn)一步的試驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)。結(jié)論：全骨髓法能夠成功分離得到純度較高的兔BMSCs。2．采用二甲基亞砜聯(lián)合高濃度葡萄糖對(duì)分離純化的第3

3、代兔BMSCs進(jìn)行體外誘導(dǎo)，觀察誘導(dǎo)前后細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，結(jié)果試驗(yàn)組在誘導(dǎo)7d出現(xiàn)細(xì)胞團(tuán)樣集落，10d獲得排列緊密的細(xì)胞團(tuán)，而對(duì)照組細(xì)胞始終未見細(xì)胞團(tuán)；用雙硫腙染色法鑒定細(xì)胞團(tuán)，結(jié)果顯示，試驗(yàn)組為陽性；用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)胰島素的表達(dá)，試驗(yàn)組顯示陽性；用ELISA法檢測(cè)分泌到培養(yǎng)液中的胰島素含量，結(jié)果顯示，試驗(yàn)組7d、10d的胰島素含量分別為(27．82±0．43)mU／L、(27．89±0．25)mU／L，與對(duì)照組的(23．39±0．20)mU／L、(25．71±0．27)mU／L比較，差異極顯著(P

4、胞。3．采用含有l(wèi)Ong／mLbFGF、lOng／mLEGF、2o,40B27的DMEM／F-12培養(yǎng)液對(duì)BMSCs誘導(dǎo)6d，用含lOng／mLHGF、lOng／mLBTC、lOng／mL活化素A、lOmmol／L尼克酰胺、2％B27的H-DMEM培養(yǎng)液對(duì)BMSCs誘導(dǎo)6d，結(jié)果試驗(yàn)組BMSCs細(xì)胞收縮并相互聚集成圓型細(xì)胞團(tuán)，對(duì)照組未見細(xì)胞團(tuán)；經(jīng)雙硫腙染色，試驗(yàn)組顯示陽性，顯示試驗(yàn)組細(xì)胞具備胰島細(xì)胞富含鋅離子的典型特征；經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)染色，試驗(yàn)組結(jié)果為陽性，顯示誘導(dǎo)后的BMSCs具備分泌胰島素的能力。結(jié)果顯示經(jīng)本方法所誘導(dǎo)出細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞為胰島細(xì)胞。結(jié)論：應(yīng)用細(xì)胞生長因子聯(lián)合作用能夠誘

5、導(dǎo)BMSCs分化為胰島細(xì)胞。4．將分離純化的BNSCs分為7組，分別標(biāo)記為a、b、c、d、e、f、g組，其中a組為對(duì)照組，自始至終用含IO％FBS的DMEM／F一12培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；b組先用無血清、含1％DMSO的DMEM／F一12誘導(dǎo)3d，再用H-DM蹦培養(yǎng)基進(jìn)行刺激培養(yǎng)；c、d、e、f組在b組的基礎(chǔ)上河南農(nóng)業(yè)大學(xué)2012屆碩士畢業(yè)論文分別在第1、3、7、10d加入lOmmol／L的尼克酰胺；g組用只含lOmmol／L尼克酰胺的DMEM／F-12培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)。誘導(dǎo)后，在b、c、d、e、f組均有胰島細(xì)胞團(tuán)出現(xiàn)，雙硫腙染色呈陽性，g組有輕微的細(xì)胞聚團(tuán)現(xiàn)象，雙硫腙染色呈現(xiàn)弱陽性，a組

6、未見細(xì)胞團(tuán)，雙硫腙染色陰性；ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，a組胰島素分泌量與b、c、d、e、f組均差異顯著，而與g組差異不顯著。結(jié)論：尼克酰胺不能獨(dú)立誘導(dǎo)BMSCs分化為胰島細(xì)胞，但是尼克酰胺與DMSO配合使用能夠促使誘導(dǎo)分化的胰島細(xì)胞分泌更多的胰島素。關(guān)鍵詞：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞：二甲基亞砜：細(xì)胞生長因子；尼克酰胺：胰島細(xì)胞：分化；兔2河南農(nóng)業(yè)大學(xué)2012屆碩士畢業(yè)論文THESTUDYoFRABBITBONEM[ARRoWMESENCHYMALSTEMCELLSDIFFERENT叢TION耵呵TOISLETCELLSSupervisor：Prof．WangXinzhuangMaster(P

7、h．D)Candidate：HedundanABSTI己ACTBonemarrowmesenchymalstemceils(BMSCs)isakindofmultiplexdifferentiationpotentialofstemcells．Itoriginatesfrommesoblast，residesmainlyinmammalianbonemarrow，andcoexistswithhematopoieticstemeells(HSCs)．BMSCsnoto