線粒體的超活染色與觀察

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1、【實驗?zāi)康摹空莆談游锛?xì)胞活體染色的原理和相關(guān)的技術(shù)。【實驗原理】活體染色是指對生活有機(jī)體的細(xì)胞或組織能著色但又無毒害的一種染色方法。它的目的是顯示生活細(xì)胞內(nèi)的某些結(jié)構(gòu)，而不影響細(xì)胞的生命活動和產(chǎn)生任何物理、化學(xué)變化以致引起細(xì)胞的死亡?；钊炯夹g(shù)可用來研究生活狀態(tài)下的細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理、病理狀態(tài)。根據(jù)所用染色劑的性質(zhì)和染色方法的不同，通常把活體染色分為體內(nèi)活染與體外活染兩類。體內(nèi)活染是以膠體狀的染料溶液注入動、植物體內(nèi)，染料的膠粒固定、堆積在細(xì)胞內(nèi)某些特殊結(jié)構(gòu)里，達(dá)到易于識別的目的。體外活染又稱超活染色，它是rti活的動、植物分離出部分細(xì)胞或組織小塊，以染料溶液浸染，染料被選擇固定在活

2、細(xì)胞的某種結(jié)構(gòu)上而顯色?；铙w染料Z所以能固定、堆積在細(xì)胞內(nèi)某些特殊的部位，主要是染料的“電化學(xué)”特性起重要作用。堿性染料的膠粒表血帶陽離子，酸性染料的膠粒表血帶陰離子，而被染的部分本身也是具有陰離子或陽離子的，這樣，它們彼此之間就發(fā)生了吸引作用。但不是任何染料皆可以作為活體染色劑之用,應(yīng)選擇那些對細(xì)胞無毒性或毒性極小的染料，而且總是要配成稀淡的溶液來使用。一般是以堿性染料最為適用，可能因為它們具有溶解在類脂質(zhì)（如卵磷脂、膽固醇等）的特性，易于被細(xì)胞吸收。詹納斯綠B（JanusgreenB）和屮性紅（neutralred）兩種堿性染料是活體染色劑【I【最重要的染料，對于線粒體和液泡系

3、的染色各有專一性。線粒體是細(xì)胞進(jìn)行呼吸作用的場所，其形態(tài)和數(shù)量隨不同物種、不同組織器官和不同的生理狀態(tài)而發(fā)生變化。詹納斯綠B是毒性較小的堿性染料，可專一性地對線粒體進(jìn)行超活染色，這是由于線粒體內(nèi)的細(xì)胞色素氧化酶系的作用，使染料始終保持氧化狀態(tài)（即有色狀態(tài)），呈藍(lán)綠色；而線粒體周圍的細(xì)胞質(zhì)中，這些染料被還原為無色的色基（即無色狀態(tài)）?！緦嶒炗闷贰?、材料：小白鼠肝臟、睪丸2、試劑：Ringer溶液：NaCl0.85g+KC10.25g+CaCb0.03g+蒸餡水100ml；1%、1/5000詹納斯綠B溶液：稱取50mg詹納斯綠B溶于5mlRinger溶液中，30-40°C加熱，使Z溶

4、解，用濾紙過濾后，即為1%原液。取1%原液lml加入49mlRinger溶液，即為1/5000工作液裝入棕色瓶中備用。3、器材：顯微鏡、解剖盤、剪刀、吸管、載玻片、蓋玻片、擦鏡紙【實驗步驟】1、用斷頭法處死小白鼠，置于解剖盤中，剪開腹腔，取小白鼠肝組織，選取邊緣較薄的肝組織0.5cm3,放入小燒杯中，用Ringer液沖洗去血污。2、在干凈的凹面載玻片的凹穴中，滴加1/5000詹納斯綠B溶液，再將肝組織塊移入染液中，注意不可將組織塊完全淹沒，要使組織塊上面部分半需在染液外，這樣細(xì)胞內(nèi)的線粒體酶系可充分得到氧化，易被染色。當(dāng)組織塊邊緣被染成藍(lán)綠色即成（一般需染20?30min）o3、吸

5、去染液，用眼科剪將組織塊著色部分剪下重置小燒杯小，滴加Ringer溶液0.5ml,用剪刀充分剪碎制懸液。4、収上述細(xì)胞懸液滴片，加蓋玻片，高倍鏡下觀察。5、將小鼠的睪丸連帶附睪一起分離取下，放置于小燒杯屮并用剪刀充分剪碎至勻漿狀，滴加1/5000詹納斯綠B溶液進(jìn)行染色，重攵第4步觀察并比較肝細(xì)胞線粒體與精子線粒體鞘?！緦嶒灲Y(jié)果】在高倍鏡下觀察到了小鼠肝細(xì)胞，肝細(xì)胞質(zhì)中的線粒體被染成藍(lán)綠色。每個細(xì)胞中都冇一些被染成藍(lán)綠色的球狀結(jié)構(gòu)，為線粒體。另外，在觀察小鼠附睪中的精子細(xì)胞可見長形的線粒體鞘也被染成藍(lán)綠色。如圖所示：O肝細(xì)胞線粒體圖1高倍鏡下肝細(xì)胞線粒體超活染色圖（10x40）精子線

6、粒體鞘圖2高倍鏡下精子線粒體鞘超活染色圖(10x40)【觀察結(jié)果分析】1、實驗制得的裝片在顯微鏡下不容易找到線粒體被染色的肝細(xì)胞，原因是染色不夠徹底。染色過程中未注意不斷添加染色劑。2、觀察時發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞周圍有許多小細(xì)胞，即紅細(xì)胞，原因是在使用Ringer液浸泡組織塊時，沒有使血完全滲出；而精子周圉有許多圓形細(xì)胞，即睪丸中的精原細(xì)胞或精母細(xì)胞。【分析與討論】1、在取肝臟吋要注意大小，大概為指甲蓋的1/3左右為宜，且不宜太厚，防止里面的線粒體不宜被染色，影響實驗結(jié)果的觀察。2、在染色過程中要注意不對把肝臟小塊全部浸沒在染色液下，這樣會使肝臟小塊進(jìn)行有氧呼吸，則詹納斯綠B無法被細(xì)胞色素氧

7、化酶充分氧化，導(dǎo)致實驗失敗。3、染色過程川要注意滴加染液，防止染色液揮發(fā)干，使肝臟小塊充分染色。4、觀察吋要注意區(qū)分肝細(xì)胞和紅細(xì)胞，肝細(xì)胞體積相對于紅細(xì)胞來說較大。5、制片之前要將組織塊盡量剪碎分散，以保證較好的觀察效果。6、在觀察小鼠精子線粒體鞘時操作要迅速，搗碎充分，才能有機(jī)會看到精子的游動過程。