葉酸殼寡糖修飾的plga納米粒作為抗腫瘤載體的研究

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1、湖北中醫(yī)藥大學碩士學位論文葉酸殼寡糖修飾的PLGA納米粒作為抗腫瘤載體的研究姓名：胡振夏申請學位級別：碩士專業(yè)：藥物分析學指導教師：符旭東20120510葉酸殼寡糖修飾的PLGA納米粒作為抗腫瘤藥物載體的研究摘要納米載藥系統(tǒng)作為腫瘤藥物的載體具有高效、低毒和緩釋的優(yōu)點，經(jīng)過配體修飾的納米粒，可特異性地被腫瘤細胞攝取，降低藥物對正常細胞的損害。紫杉醇(paclitaxel，PTX)是從紅豆杉屬植物的樹皮中提取得到的二萜類化合物，具有獨特的微管穩(wěn)定作用，臨床上主要適用于卵巢癌和乳腺癌。聚乳酸．羥基乙

2、酸共聚物(PLGA)是聚酯類高分子材料，由乳酸和羥基乙酸聚合而成，其在體內(nèi)的最終代謝產(chǎn)物為水和二氧化碳，具有良好的生物可降解性和組織相容性，作為藥用輔料已被美國FDA批準。端羧基PLGA(PLGA．COOH)是在聚合時保留聚合物鏈末端的羧基，以便可以對聚合物進行進一步的改性反應。葉酸是人體必需的一種維生素，但人體無法自行合成，必須從食物中攝取。葉酸受體是細胞膜表面的一種糖蛋白，葉酸與葉酸受體結(jié)合后，細胞通過內(nèi)吐作用攝取葉酸。葉酸受體在肺、胸腺、腎等正常組織中呈低水平表達，而在一些腫瘤組織呈高水平

3、表達。用葉酸對納米載藥系統(tǒng)進行修飾可以賦予納米載藥系統(tǒng)主動靶向性。本課題以端羧基PLGA為載體，制備了載紫杉醇的PLGA納米粒。以載藥量、包封率、納米粒的粒徑為主要考察指標，優(yōu)化了紫杉醇PLGA納米粒的處方和制備工藝。采用乳化溶劑揮發(fā)法制備納米粒，通過單因素實驗對納米粒的處方和制備工藝進行了優(yōu)化。優(yōu)化得到的處方和制備工藝為：lmg紫杉醇、50mgPLGA溶于2．5mLCH2C12，乳化劑選用30mL2％PVA，超聲條件為：超聲2s，間歇2s，超聲10min后將初乳倒入400r·mino攪拌下的等

4、體積的純化水中，攪拌4h揮發(fā)有機溶劑。制備得到的納米粒平均粒徑為284nm，載藥量為1．13％±0．09％，包封率為57．77％±1．16％。采用界面沉積法制備紫杉醇PLGA納米粒，通過因子設計．效應面法對納米粒的處方和制備工藝進行優(yōu)化。優(yōu)化得到的處方和制備工藝為：紫杉醇2mg、PLGA60mg，溶于6mL丙酮中作為有機相，在800r·minl攪拌下，將有機相逐滴加入30mL的I％PVA溶液中，攪拌約10min后將轉(zhuǎn)速減至400r·minl，繼續(xù)攪拌5h使丙酮揮干，得到帶藍乳光的澄清溶液，0．4

5、59m微孔濾膜濾過后即得納米?；鞈乙?，得到的納米粒粒徑為281±lnm，電位為．30．1±O．3mV，包封率為57．430／硅1．61％。由于界面沉積法制備納米粒具有制備簡單，包封率較高等優(yōu)點，最終以界面沉積法制備紫杉醇PLGA納米粒。采用碳二亞胺法制備了葉酸偶聯(lián)的殼寡糖。用1一乙基．(3．二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl)對葉酸的羧基進行活化，再與殼聚糖和殼寡糖上的氨基結(jié)合即得，并用紫外光譜和紅外光譜對產(chǎn)物進行了確證。以葉酸的濃度及其對應的在363nm處的吸光值，計算得到了葉酸的

6、標準曲線：A=8．1789C+0．0681，R=0．9999(其中濃度單位為mg-mLd)。將制備得到的葉酸殼寡糖溶于水后測定其在363nm處的吸光值，計算葉酸偶聯(lián)率。最后確定的反應條件為：葉酸約220mg，EDC·HCl約192mg，溶解于30mL0．1mol／LNaOH溶液中，加入約525mg殼寡糖，攪拌下加入葉酸溶液，室溫下避光反應16h。反應結(jié)束后用O．1mol／LHCl調(diào)節(jié)反應液pH至7后過濾，將濾液用大量純化水透析24h后凍干即得葉酸殼寡糖。該法制備的葉酸殼寡糖的葉酸偶聯(lián)率約為24．

7、39％。用葉酸偶聯(lián)的殼寡糖對PLGA納米粒修飾。用EDC對PLGA納米粒表面的端羧基進行活化，再與葉酸殼寡糖上的氨基連接。反應條件為：稱取30mg葉酸殼寡糖和約2mgEDC，用10mL純化水溶解，攪拌下，加入納米?；鞈乙?，室溫下反應3h，0．45I．tm微孔濾膜濾過即得葉酸殼寡糖修飾的PLGA納米混懸液。修飾后的納米粒粒徑為321±O．76nm，電位為22．6±0．26mV，載藥量5．1±0．25％，包封率41．96±1．96％，納米粒的葉酸偶聯(lián)率約為8．87％。在體外細胞實驗時，選用了SKOV

8、-3卵巢癌細胞系，用MTT法考察lI了紫杉醇納米?；鞈乙杭白仙即既芤簩毎囊种菩Ч?。通過前期實驗，初步篩選出最佳紫杉醇濃度為O．1ixg·ml～，作用時間為48h。實驗顯示紫杉醇在作用時間48h時對細胞的抑制作用達到最大，48h后，紫杉醇溶液對細胞的抑制作用開始下降。而納米粒隨著作用時間的延長，對細胞的抑制率上升。在作用時間96h時，修飾后納米粒對細胞的抑制率與紫杉醇溶液對細胞的抑制率相當。在不同作用時間下，修飾后紫杉醇納米粒對細胞的抑制率均強于相同濃度的未經(jīng)修飾的納米粒。主題詞：PLGA納米