人中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶與其抑制劑研究

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1、.人中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶及其抑制劑研究人中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(humanneutrophilelastase，HNE)在機(jī)體各種炎癥反應(yīng)、組織損傷重構(gòu)（如肺炎）、成人呼吸窘迫綜合征、肺纖維化、急（慢）性肺損傷、肺水腫、動(dòng)脈粥樣硬化、硬皮病等病理過(guò)程中起重要作用，并且具有促進(jìn)病毒、細(xì)菌的侵人及癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的功能。炎癥機(jī)制研究顯示，體內(nèi)該酶及其內(nèi)源性抑制劑的平衡失調(diào)可導(dǎo)致組織基質(zhì)降解和炎癥的惡化。目前，國(guó)外用HNE抑制劑來(lái)治療這一類炎癥疾病的研究非常廣泛，并已成功開發(fā)出第一個(gè)以抑制HNE為治療途徑的上市藥物西維來(lái)司鈉（sivelestatsodiumhydrate），從而促進(jìn)

2、了HNE抑制劑的研究與開發(fā)。????1　BM的生理、病理作用及結(jié)構(gòu)特征????HNE，又稱人白細(xì)胞彈性蛋白酶（humanleukocyteelastase，IRE），屬于基質(zhì)金屬蛋白酶類（matrixmetalloproteinases,MMPs），即MMP-12,是一種金屬離子依賴性基質(zhì)降解酶，需要微量Zn2+和Ca2+離子的存在才具有酶活性，其底物類型非常廣泛，幾乎可降解細(xì)胞外基質(zhì)中的所有蛋白。白細(xì)胞、巨嗜細(xì)胞、肥大細(xì)胞內(nèi)都存在著這種酶，中性粒細(xì)胞中其含量很高，大約每106個(gè)細(xì)胞中含有HNE的總量為3μg。生理?xiàng)l件下，HNE可以協(xié)助清除異源性物質(zhì)，促進(jìn)吞噬細(xì)胞消除有

3、害病菌，并幫助消化受損組織，有助于傷口的愈合與組織再生。而HNE過(guò)量表達(dá)則會(huì)對(duì)機(jī)體組織、基質(zhì)造成危害，表現(xiàn)為破壞血管壁組分，使中性粒細(xì)胞更容易滲出血管并向炎癥部位趨化集中及釋放IL-8、TNF-α等炎癥因子；它還能降解細(xì)胞基質(zhì)，催化caspase3誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。據(jù)報(bào)道，HNE還能增強(qiáng)病毒、細(xì)菌及癌細(xì)胞對(duì)正常細(xì)胞的黏附能力，促進(jìn)微生物的入侵及癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。????HNE存在于中性粒細(xì)胞嗜苯胺藍(lán)顆粒中，是由218個(gè)氨基酸組成的單一肽鏈，分子質(zhì)量大約25.9...kD，含4個(gè)二硫鍵，是絲氨酸蛋白酶家族一員，因此與其他絲氨酸家族蛋白酶具有30%～40％的同源性，最適pH

4、值接近中性。HNE的基因位于19號(hào)染色體的短臂末端，是50kb的DNA片段，成熟的中性粒細(xì)胞中并無(wú)HNE的mRNA表達(dá)，說(shuō)明此種酶只在未成熟的骨髓細(xì)胞中合成。酶的催化中心由His41、Asp88和Ser173三個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，空間位置相互靠近，均由發(fā)夾結(jié)構(gòu)延伸到蛋白表面，其中Ser殘基側(cè)鏈上羥基具有很高的親核性，容易結(jié)合不帶電的小分子氨基酸，如Val、Ala、Leu、Met等。????2　BM抑制劑????HNE對(duì)機(jī)體會(huì)產(chǎn)生各種病理作用，故關(guān)于其抑制劑的研究也受到廣泛關(guān)注，其中包括內(nèi)源性抑制劑、合成的外源性抑制劑（蛋白類、擬肽和雜環(huán)化合物）以及天然提取物等。????2

5、.1　內(nèi)源性抑制劑????人體內(nèi)存在許多種針對(duì)HNE的快速反應(yīng)抑制蛋白，每一種蛋白存在于不同的生理部位而發(fā)揮不同的作用。選擇性HNE抑制劑Elafin存在于皮膚及上皮組織中，分子質(zhì)量為7kD，是酸穩(wěn)定性多膚；α1-抗蛋白酶（α1-antiprotease）在血漿中具高濃度，并由此進(jìn)入組織發(fā)揮作用。上述內(nèi)源性抑制劑包括α2-巨球蛋白均為分泌性彈性蛋白酶抑制劑，其中α1-抗蛋白酶被認(rèn)為是在體內(nèi)各種臟器中起主導(dǎo)作用的內(nèi)源性HNE抑制劑。????2.1.1　α1-抗蛋白酶　它在許多生理、病理過(guò)程中（如血液凝結(jié)、纖維蛋白溶解、炎癥等）起調(diào)節(jié)蛋白分解的作用，并且對(duì)防止蛋白水解性組織

6、損傷起重要作用。據(jù)報(bào)道先天性α1-抗蛋白酶缺損極易引發(fā)肺氣腫和自發(fā)性肺纖維化（idiopathicpulmonaryfibrosis）。????α1-抗蛋白酶屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族成員，存在于血漿中，平均分子質(zhì)量約50kD，含有3個(gè)β片層結(jié)構(gòu)和若干α螺旋結(jié)構(gòu)，其中Met358決定了它對(duì)HNE的抑制特異性，HNE與之結(jié)合后形成穩(wěn)定酯結(jié)構(gòu)，致使酶的活性中心構(gòu)象發(fā)生改變，不能去酞基化，這種抑制機(jī)制被稱為自殺性底物抑制。對(duì)α1-抗蛋白酶的結(jié)構(gòu)研究顯示，它和其他HNE拮抗劑一樣，在酶結(jié)合位點(diǎn)或附近的Met上的硫醚鍵對(duì)化學(xué)氧化非常敏感，一旦Met被亞砜化后，α1-抗蛋白酶即失

7、活。...????在體內(nèi)氧化自由基的增多是造成這種內(nèi)源性抑制劑失活的主要原因，中性粒細(xì)胞分泌出的髓過(guò)氧化物酶通過(guò)過(guò)氧化酶-過(guò)氧化氫-鹵化物系統(tǒng)使α1_抗蛋白酶氧化失活，從而達(dá)到HNE活性增高，促進(jìn)細(xì)胞滲透轉(zhuǎn)移的目的。在體外試驗(yàn)中，中性粒細(xì)胞中的過(guò)氧化物系統(tǒng)可使α1-抗蛋白酶在10秒之內(nèi)失活50%，20秒之內(nèi)完全失活。????2.1.2　Elafin　它是一種被研究得比較深入的內(nèi)源性抑制劑，又稱為彈力素，屬于Trappin-2基因家族。它在多種上皮組織中表達(dá)，如毛囊、食管、陰道和口腔中等。在人皮膚正常組織中沒有表達(dá)，但在皮膚受外傷和牛皮癬等