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1、山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文豬圓環(huán)病毒2型間接ELISA檢測方法的建立及抗ORF2蛋白單克隆抗體的制備姓名：姚永紅申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：預(yù)防獸醫(yī)學(xué)指導(dǎo)教師：周恩民20120615山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文中文摘要豬圓壞病毒2型(Porcinecircovirus2，PCV2)是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征的病原，屬圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，為已知的最小的動(dòng)物病毒之一。斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征最早于1991年在加拿大斷奶仔豬中被發(fā)現(xiàn)，此后在世界其他國家也相繼被檢出。該病不但可以引起斷奶仔豬衰竭、死亡，還與先天性震顫、豬皮炎腎炎綜合征和呼吸道疾病綜合征有關(guān)。更為嚴(yán)重的是，PCV2感染所引起的豬免疫抑制
2、會(huì)直接導(dǎo)致其他傳染病免疫的失敗，并引起其他病原的繼發(fā)感染，造成的間接損失難以估算。PCV2無囊膜，含有共價(jià)閉合的單股環(huán)狀負(fù)鏈DNA，基因全長為1767bp或1768bp，共有包括ORFl和ORF2在內(nèi)的11個(gè)開放閱讀框。其中，ORF2全長702bp，編碼由234個(gè)氨基酸構(gòu)成的衣殼蛋白Cap。Cap蛋白是PCV2的主要結(jié)構(gòu)蛋白，具有較好的免疫原性，是檢測該病毒特異性抗體的理想抗原。本研究設(shè)計(jì)并擴(kuò)增了去掉N端信號(hào)肽的516bp大小的ORF2片段，成功表達(dá)并純化，以此作為包被抗原，建立了檢測臨床抗PCV2抗體的間接ELISA檢測方法，同時(shí)以此作為免疫原，利用淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)篩選特異性針對O
3、RF2蛋白的單克隆抗體(Monoclonalantibodies，MAb)，為PCV2的進(jìn)一步研究和診斷提供技術(shù)手段。研究主要包括以下內(nèi)容：1、PCV2ORF2基因片段的克隆與原核表達(dá)本研究擴(kuò)增了去掉N端信號(hào)肽后516bp大小的ORF2片段，并在大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)E．coliRosetta中成功表達(dá)。融合蛋白的相對分子質(zhì)量約為25KD，能為PCV2陽性血清所識(shí)別。2、以表達(dá)的ORF2蛋白為包被抗原，建立PCV2的間接ELISA檢測方法對間接ELISA檢測方法的條件進(jìn)行了優(yōu)化，最終選擇了ORF2蛋白的最適包被量為lug／ml，包被緩沖液為0．06M碳酸鹽緩沖液，最適包被條件為4"C過夜
4、；封閉液為含有10％FBS的PBS’T，反應(yīng)條件37℃，1h；待檢血清稀釋度為1：80，酶標(biāo)二抗工作濃度1：2000，反應(yīng)條件均為37℃，1h：底物37℃顯色15min。建立的間接ELSA對PCV2抗體具有很好的特異性和敏感性。3、ORF2蛋白單克隆抗體的制備與鑒定以純化的ORF2蛋白作為免疫原，腹腔免疫接種6．8周齡雌性BALB／c小鼠，最后一次加強(qiáng)免疫五天后進(jìn)行細(xì)胞融合。間接ELISA方法篩選陽性細(xì)胞克隆，亞克隆直到獲得可產(chǎn)生單克隆抗體的穩(wěn)定細(xì)胞系2株，分別命名為3H3和3F2，其亞型均為IgGl。豬網(wǎng)環(huán)稍毒2型間接ELISA檢測方法的建立及ORF2蛋[j單克隆抗體的制備ELISA
5、測定2株單抗培養(yǎng)上清及其所制備的腹水效價(jià)，這2株單抗細(xì)胞培養(yǎng)上清在l：1600，腹水在l：51200時(shí)其OD450吸光值的P／N大于2．1，表明制備的單抗具有較高的效價(jià)。Westernblot分析結(jié)果顯示兩株單抗均能與ORF2蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)。這2株單抗的獲得為進(jìn)一步研究PCV2ORF2基因的功能及建立準(zhǔn)確快速的PCV2的診斷方法提供了工具。關(guān)鍵詞：豬圓環(huán)病毒2型；OKF2；間接ELISA；單克隆抗體2山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文DevelopmentandApplicationofIndirectELISAforPorcineCircovirusType2andPreparationM
6、onoclonalAntibodiesagainstORF2AbstractPorcinecircovirus2isthemainpathogenofpostweaningmultisystemicwastingsyndrome(PMWS)，whichwasdividedintothefamilycircovirus，genuscircovirus．PMWSwasinitiallyrecognizedinweaningpigletsofaCanadianherdin1991，sincethenPMWShasbeendetectedinvirtuallyallregionsofthewo
7、rldwherepigsareproduced．PCV2hasincreasinglybeenassociatedwithvariousdiseasesyndromesinpigs，suchascongenitaltrembled，porcinedermatitisnephropathysyndrome(PDNS)，porcinerespiratorydiseasecomplex．Whatisworse，PCV2calldepresstheim
