脂聯(lián)素對apap誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷的保護作用

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1、溫州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文脂聯(lián)素對APAP誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷的保護作用姓名：龔琦申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：中藥學(xué)指導(dǎo)教師：李校堃；林灼鋒2012-05-22脂聯(lián)素對APAP誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷的保護作用中文摘要目的：對乙酰氨基酚(APAP)是臨床上常用的解熱鎮(zhèn)痛藥，長期或過量使用可引起機體的肝臟損傷，本文通過功能獲得和功能缺失的方法，即外源性給藥和基因敲除的方法，闡明脂聯(lián)素(APN)對APAP引起的小鼠肝臟損傷的影響，并進一步探討其作用機制。方法：(1)APAP作用后對小鼠肝臟的影響及機體脂聯(lián)素的變化取

2、10只8周齡雄性C57BL／6jWildtype小鼠隨機分為兩組，其中一組腹腔注射0．5mlAPAP(500mg／kg)，另一組注射相同體積PBS為對照，分別在注射前(0h)及注射后2h、4h、6h、12h、24h從尾靜脈收集其血液樣品，48h后處死上述兩組老鼠，收集其血樣及各組織。觀察APAP處理后小鼠肝臟損傷的變化狀況：采用全自動生化儀對血清中ALT、AST水平進行測定、H&E染色觀察組織形態(tài)學(xué)變化；同時，觀察APAP處理后小鼠血清中APN的變化狀況，采用Q—PCR的方法檢測小鼠相關(guān)組織中脂

3、聯(lián)素mRNA水平變化。(2)外源性重組APN對APAP誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷的影響取10只8周齡雄性C57BL／6jWT小鼠隨機分為兩組，一組經(jīng)尾靜脈注射0．1mlAPN重組蛋白(1．5mg／m1)，另外一組注射PBS為對照，分別于注射前(oh)及注射后1h、2h、3h、4h、6h從尾靜脈收集其血液樣品，采用ELISA方法檢測APN處理后體內(nèi)APN代謝的變化；另取上述相同小鼠分為兩組，其中一組經(jīng)尾靜脈注射O．1ml重組APN蛋白(1．Smg／m1)，另一組以注射PBS為對照，半小時后兩組小鼠再同時給

4、予腹腔注射lml秈(800mg／kg)，于APN或PBS注射前(oh)及之后2h、4h、6h從尾靜脈收集其血清樣品，并于8h時處死小鼠，收集其血清及肝臟組織，檢測血清中APN、ALT、AST的變化情況，H&E染色觀察其組織形態(tài)學(xué)上的差異，采用TUNEL檢測試劑盒檢測其肝臟組織中凋亡的大小，并采用westernblot的方法檢測caspase3活性的變化。(3)APN基因缺失后APAP對其小鼠急性肝損傷的影響取10只8周齡雄性C57BL／6j脂聯(lián)素基因缺失(APNKO)小鼠，同時以相同年齡及背景的

5、WT小鼠作為對照，每組小鼠以腹腔注射的方式給予lml的’5溫州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文腳(900mg／kg)，觀察36小時內(nèi)兩組小鼠存活率的多少；另再各取5只8周齡雄性APNKO及WT對照組小鼠，腹腔注射lml的APAP(500mg／kg)作用12h后收集其血樣及肝臟組織，觀察血清中ALT、AST的變化，組織形態(tài)學(xué)的改變及凋亡的大小，采用相關(guān)檢測試劑盒檢測各組小鼠肝臟GSH、ROS的變化，同時采用westernblot的方法檢測easpase3活性的變化。(4)APAP誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷的信號機制的研

6、究取上述(3)中500mg／kgAPAP劑量下的APNKO及WT小鼠肝臟組織樣品，另再取兩組同樣背景年齡的PBS處理的APNKO及WT小鼠肝臟樣品作為對照，采用Westernblot的方法檢測ER-stress通路相關(guān)標記蛋白P．elF2a、elF2a、BIP、ATF3、CHOP蛋白的變化；同時檢測autophagy通路相關(guān)標記蛋白ATG7、LC3、p62的變化，同時檢測P—AMPK、t-AMPK、Sirtl蛋白的改變，從而揭示其相關(guān)的分子信號作用機制。結(jié)果：(1)500mg／kgAPAP引發(fā)了

7、小鼠的急性肝臟損傷，并下調(diào)了機體A1PN的水平與PBS處理的對照組小鼠相比，500mg／kg劑量的APAP作用WT小鼠造成了其血清ALT、AST急劇上升并在24h內(nèi)達到最高值，其后再緩慢下降，仍高于對照組水平(p

8、均顯著下降；同時，APNmRNA表達水平在皮下脂肪及附睪脂肪內(nèi)也顯著降低(p<0．05)。(2)外源重組APN蛋白緩解APAP誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷尾靜脈注射APN重組蛋白后lh時，小鼠血清APN循環(huán)水平達到了最高值，其后再緩慢下降，6小時后回到基線水平。在APN預(yù)處理30min后再給予APAP的小鼠中，其血清APN濃度于2h時達到最高值，之后再緩慢下降，而對照組中PBS預(yù)處理的APAP作用小鼠則引起其血清APN水平持續(xù)下降，兩者相比具有統(tǒng)計學(xué)意義(p