opg調(diào)控破骨細(xì)胞nf-κb通路的研究

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1、OPG調(diào)控破骨細(xì)胞NF．10B通路的研究TheregulationofOPGonNF--loBpathwayinosteoclast研究生：王世濤指導(dǎo)教師：劉宗平教授揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院I臨床獸醫(yī)學(xué)內(nèi)科實(shí)驗(yàn)室2012．5王世濤OPG調(diào)控破骨細(xì)胞NF．Id3通路的研究OPG調(diào)控破骨細(xì)胞NF．Id3通路的研究中文摘要機(jī)體維持骨組織不斷更新，保持生命活力是依靠骨代謝完成的。骨代謝平衡一旦被打破，機(jī)體便會(huì)出現(xiàn)各類代謝性骨病，其中骨營(yíng)養(yǎng)不良性疾病如骨質(zhì)疏松主要是由破骨細(xì)胞(osteoclasts，OC)產(chǎn)生的骨吸收大于成骨細(xì)胞(osteoblasts，OB)產(chǎn)生的骨再建所引起的。研究

2、發(fā)現(xiàn)，當(dāng)機(jī)體受到骨吸收刺激時(shí)，成骨細(xì)胞／基質(zhì)細(xì)胞膜上表達(dá)的細(xì)胞核因子．KB受體活化因子配基(receptoractivatorofnuclearfactor-r,Bligand，RANKL)，通過與破骨細(xì)胞前體細(xì)胞膜上細(xì)胞核因子．1(B受體活化因子(receptoractivatorofnuclearfactor-r．B，凡蝌K)結(jié)合，促進(jìn)OC的分化和成熟。核因子．rd3(NF．r．B)信號(hào)通路是參與調(diào)控OPG抑制OC分化成熟的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，吡咯烷二硫氨基甲酸(PDTC)作為NF．r,B特異性抑制劑被廣泛應(yīng)用。本研究采用OPG瓜ANK依ANKL調(diào)控途徑在體外誘導(dǎo)破骨

3、細(xì)胞前體細(xì)胞凡州264．7細(xì)胞株生成OC，在此基礎(chǔ)上研究OPG抑制動(dòng)物OC分化成熟的NF-rd3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，為從分子水平揭示動(dòng)物骨營(yíng)養(yǎng)不良性疾病的發(fā)生及防治提供理論依據(jù)。1．RAW264．7細(xì)胞培養(yǎng)及RANKL、OPG、PDTC對(duì)細(xì)胞增殖的影響RAW264．7細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)基中，于5％C02，37。C培養(yǎng)箱培養(yǎng)。MTT法檢測(cè)其生長(zhǎng)曲線，發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間的增加，細(xì)胞增殖速度逐漸增加，第3d進(jìn)入對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，第5d進(jìn)入穩(wěn)定期。通過MTT法，檢測(cè)不同濃度RANKL(0、10、30、50、70ng／mL)、OPG(0、10、20、40、50ng／mL)和PDTC(0、10、50

4、、100、150pM)對(duì)該細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果表明：不同濃度RANKL均抑制細(xì)胞的增殖，隨濃度增加抑制作用增強(qiáng)，選取30ng／mL為實(shí)驗(yàn)濃度；OPG在0--．50ng／mL濃度范圍內(nèi)，對(duì)細(xì)胞增殖無明顯作用，選取0、20、50ng／mL為實(shí)驗(yàn)濃度；不同濃度的PDTC均抑制細(xì)胞的增殖，隨濃度增加抑制作用增強(qiáng)，選取100taM為作用濃度。2．RANKL體外誘導(dǎo)RAW264．7細(xì)胞株分化為OC及OPG的影響RAW264．7細(xì)胞以5×103ceUs／mL密度接種于96孔板，加入cL．MEM培養(yǎng)基，于5％C02，37"C培養(yǎng)箱培養(yǎng)，隔天換液，至第6d。5％多聚甲醛固定，以抗酒石酸酸

5、性磷酸酶(TRAP)試劑盒染色，其中含有三個(gè)或三個(gè)以上細(xì)胞核的TRAP陽性多核細(xì)胞即為OC。在此基礎(chǔ)上，分組：A組為空白組，B組添加20ng／mLOPG，C組添加30ng／mLRANKL，D組添加30ng／mLRANKL+20ng／mLOPG，E組添加30ng／mLRANKL+50ng／mLOPG。揚(yáng)州大學(xué)碩士學(xué)位論文Il一誘導(dǎo)至第6d，5％多聚甲醛固定，TRAP試劑盒染色，生成的OC計(jì)數(shù)，結(jié)果表明：A、B組只有極少量的OC生成；C組生成TRAP陽性多核細(xì)胞數(shù)量極顯著高于其他組(尸<0．01)：D組生成TRAP陽性多核細(xì)胞數(shù)量極顯著低于C組(P

6、、B、E組(戶<0．01)；E組生成TRAP陽性多核細(xì)胞數(shù)量極顯著低于C、D組(P<0．01)。由此可見，C、D、E組在添加相同RANKL的基礎(chǔ)上，隨著添加OPG濃度的增加，OC數(shù)量逐漸減少，至50ng／mLOPG時(shí)，只有極少量的OC生成。3．OPG對(duì)OC形成過程中NF．KB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路關(guān)鍵信號(hào)分子表達(dá)的影響在誘導(dǎo)RAW264．7細(xì)胞分化生成OC的過程中進(jìn)行如下處理，A組為對(duì)照組，B組添加20ng／mLOPG，C組添加30ng／mLRANKL，D組添加30ng／mLRANKL+20ng／mLOPG，E組添加30ng／mLRANKL+50ng／mLOPG。提取細(xì)胞核蛋白、

7、漿蛋白和細(xì)胞全蛋白，通過蛋白印跡(WesternBolt)技術(shù)檢測(cè)NF．r,Bp65及IrB的表達(dá)。結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組NF．r,Bp65表達(dá)量隨添加OPG濃度的增加而降低，細(xì)胞Ird3et、IIcBB表達(dá)量逐漸增加。添加100gMPDTC阻斷NF．rB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路后，檢測(cè)上述關(guān)鍵信號(hào)分子的表達(dá)。在誘導(dǎo)RAW264．7細(xì)胞分化生成OC的過程中進(jìn)行如下處理，A組添加100gMPDTC，B組添加20ng／mLOPG+100gMPDTC，C組添加30ng／mLRANKL+100gMPDTC，D組添加30ng／mLRANKL+20ng／mLOPG+1