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1、山東大學(xué)博士學(xué)位論文Wnt/β--catenin信號通路在ALS轉(zhuǎn)基因鼠發(fā)病中作用及其機制的研究姓名：陳燕春申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：人體解剖與組織胚胎學(xué)指導(dǎo)教師：管英俊;劉凱2012-10-15山東大學(xué)博士學(xué)位論文Wnt／p．catenin信號通路在ALS轉(zhuǎn)基因鼠發(fā)病中作用及其機制的研究博士研究生：陳燕春專業(yè)：人體解剖與組織胚胎學(xué)導(dǎo)師：管英俊教授劉凱教授中文摘要【研究背景】肌萎縮側(cè)索硬化癥(amyotrophiclateralsclerosis，ALS)是由脊髓、腦干運動神經(jīng)元進行性變性所致的慢性神經(jīng)退行性疾病
2、。臨床表現(xiàn)為進行性全身肌肉無力、萎縮，最終導(dǎo)致癱瘓甚至死亡。研究發(fā)現(xiàn)，家族性ALS病例中，20％的患者與銅鋅超氧化物岐化酶l(CuZnsuperoxidedismutase，SODl)基因突變有關(guān)，突變的類型超過125種，但病人的癥狀都相似，推測運動神經(jīng)元的變性是一種或多種因素共同作用的結(jié)果。表達突變?nèi)祟怱ODl的轉(zhuǎn)基因小鼠能夠再現(xiàn)ALS的癥狀，而表達相同拷貝的野生型人類SODl的小鼠卻沒有出現(xiàn)疾病的癥狀。SODlc'93A轉(zhuǎn)基因小鼠是目前研究ALS發(fā)病機制的可靠動物模型。研究發(fā)現(xiàn)，ALS發(fā)病與生長因子缺乏、線
3、粒體異常、軸突異常、氧化應(yīng)激、炎癥、興奮性毒性、蛋白折疊等有關(guān)，但是選擇性運動神經(jīng)元的退化機制仍不明確，尚無有效地治療方法。經(jīng)典Wnt／p．catenin信號通路是由多種蛋白質(zhì)組成并相互作用的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，在多種細(xì)胞的增殖、分化、運動及形態(tài)發(fā)生中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，Wnt信號通路異常與多種神經(jīng)退行性疾病相關(guān)，如阿爾茨海默病(Alzheimer’SDisease，An)、帕金森病(Parkinson’Sdisease，PD)、亨廷頓舞蹈病(Huntington’Sdisease，HD)等。但是，Wnt信號通路在A
4、LS發(fā)病過程中的作用尚不清楚。基于上述分析，我們設(shè)計了本實驗。本實驗采用SODlG93A轉(zhuǎn)基因小鼠動物模型、原代培養(yǎng)的SODlc'93A轉(zhuǎn)基因鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞模型和SODl突變型神經(jīng)細(xì)胞模型(N2a神經(jīng)細(xì)胞模型)，應(yīng)用免疫熒光技術(shù)、激光共聚焦顯微鏡技術(shù)、RT-PCR、Westernblot、細(xì)胞培養(yǎng)等形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法，體內(nèi)與體外實山東大學(xué)博士學(xué)位論文驗相結(jié)合，從細(xì)胞、蛋白、基因等不同水平綜合檢測了Wnt／p．catenin信號通路中關(guān)鍵信號分子的表達變化，研究了Wnt／p．catenin信號通路與ALS發(fā)病
5、的關(guān)系，揭示了Wnt／p．catenin信號通路在ALS脊髓發(fā)病中的作用及機制，以期尋找治療ALS的新靶點，為防治ALS的發(fā)生提供新的實驗依據(jù)?！狙芯糠椒ā?．選擇ALS轉(zhuǎn)基因小鼠60只，隨機分為三組，分別于發(fā)病早期、中期和晚期不同階段(95d，108d，122d)處死動物、分離脊髓，部分標(biāo)本提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，應(yīng)用RT-PCR方法檢測Wnt／13．catenin信號通路關(guān)鍵信號分子wm配體(包括Wnt3a、Wnt2和Wm7a)、GSK-3p、13-catenin和CyclinD1在ALS轉(zhuǎn)基因鼠脊
6、髓mRNA水平的表達變化。部分標(biāo)本提取總蛋白或核蛋白，應(yīng)用Westernblot方法檢測關(guān)鍵信號分子蛋白水平的表達變化。部分動物在ALS轉(zhuǎn)基因鼠發(fā)病初期(90d)腹腔注射BrdU(50mg／kg體重，每天1次，連續(xù)5天)，在最后一次注射BrdU后1、14、28d(即95d，108d，122d)用4％的多聚甲醛行心臟灌注固定，分離出脊髓，制備冰凍切片，應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色、免疫熒光雙標(biāo)以及多標(biāo)染色技術(shù)檢測關(guān)鍵信號分子在ALS轉(zhuǎn)基因鼠脊髓中的表達規(guī)律以及與細(xì)胞增殖、分化的相關(guān)關(guān)系。每組均選擇同窩出生的野生型鼠做為對
7、照組。2．取出生第3d的ALS新生鼠，無菌條件下取出脊髓，胰蛋白酶消化，體外培養(yǎng)、純化原代星形膠質(zhì)細(xì)胞，以培養(yǎng)同窩出生的野生型鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞作為對照組。應(yīng)用Westernblot和免疫熒光雙標(biāo)染色方法檢測ALS鼠和野生型鼠原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞中Wnt／p．catenin信號通路關(guān)鍵信號分子Wnt3a、fl-catenin和CyclinD1的表達變化。3．選取小鼠成神經(jīng)瘤細(xì)胞系N2a，分別轉(zhuǎn)染pEGFP．WT．SODl和pEGFP．G93A．SODl質(zhì)粒，制備野生型和SODl突變型神經(jīng)細(xì)胞模型。部分細(xì)胞于轉(zhuǎn)染
8、后24h和48h提取蛋白，部分細(xì)胞用于制備細(xì)胞爬片。應(yīng)用Westemblot和免疫熒光染色方法檢測ALS細(xì)胞模型中Wnt／p．catenin信號通路關(guān)鍵信號分子Wnt3a、13-eatenin和CyclinD1的表達變化。【結(jié)果】1．Wnt／13．catenin信號通路關(guān)鍵信號分子在ALS轉(zhuǎn)基因鼠脊髓中的表達變化2山東大學(xué)博士學(xué)位論文(1)Wnt3a、Wnt2和Wnt7a配體在ALS轉(zhuǎn)
