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《山東地區(qū)水貂綠膿桿菌分離鑒定、耐藥性檢測及toxa基因的克隆表達(dá)》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、Isolation，IdentificationandDrugResistanceDetectionofMinkYseudomonasaeruglnosain是ihanaon9111h●“_’RegionandCloning，ExpressionofToxAGeneThesissubmittedto(夏ngdaoAgriculturalUniversityInFulfillmentoftheRequirementfortheDegreeofMasterofAgronomyWangYing(CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedi
2、cine)Supervisor：Prof．ShahHuQingdao．ChinaJune，2012l愀嬲獨創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的論文是我個人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得青島農(nóng)業(yè)大學(xué)或其它教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明并表示了謝意。研究生簽名：衫扎時間：為幾年6月2礦日關(guān)于論文使用授權(quán)的說明本人完全了解青島農(nóng)業(yè)大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：學(xué)校有權(quán)保留送交論文的復(fù)印件
3、和磁盤，允許論文被查閱和借閱，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。同意青島農(nóng)業(yè)大學(xué)可以用不同方式在不同媒體上發(fā)表、傳播學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容。(保密的學(xué)位論文在解密后應(yīng)遵守此協(xié)議)研究生簽名：王象定一時間：≥。)z，年6月2礦日導(dǎo)師簽名：時間：加}侈年易月乙聲，青島農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文摘要山東地區(qū)水貂綠膿桿菌分離鑒定、耐藥性檢測及ToxA基因的克隆表達(dá)摘要本試驗從山東各地暴發(fā)的水貂出血性肺炎的病例中分離出15株疑似綠膿桿菌的病茵，通過生理生化鑒定以及分子生物學(xué)鑒定確定為綠膿桿菌；然后對15株綠膿桿菌進(jìn)行血清型分離，血清型鑒定結(jié)果表明山東省地區(qū)水貂
4、群中流行G型、B型、E型三種血清型致病性綠膿桿菌，其中G型為山東地區(qū)主要流4i--血清型，占分離菌株的80％。本試驗對分離的15株綠膿桿菌進(jìn)行了藥敏試驗，結(jié)果顯示山東地區(qū)水貂綠膿桿菌對10種藥物已普遍產(chǎn)生耐藥性，其中對復(fù)方新諾明、四環(huán)素、頭孢膚肟和羧芐青霉素四種藥物耐藥性最強(qiáng)，多數(shù)菌株表現(xiàn)為0抑菌環(huán)；其次對近年來在養(yǎng)貂業(yè)中普遍應(yīng)用的慶大霉素和茵必治的耐藥性也很強(qiáng)，而對丁胺卡那霉素、復(fù)達(dá)欣、先鋒必素、環(huán)丙沙星等四種藥物普遍敏感。本試驗通過PCR技術(shù)，以本實驗室分離到的綠膿桿茵的染色體DNA為模板，擴(kuò)增表達(dá)外毒素A蛋白的ToxA基因，將產(chǎn)物克隆與pMD．18T載體連接，
5、鑒定后測序。利用DNAs砑R軟件將測定的12株序列與Gerd3ank中的標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)毒株P(guān)Al03株和PA01株toxA基因序列進(jìn)行比較，繪制toxA基因系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果表明PA2、PA3、PA4、PA7、PA8、PA9、PAl0、PAll與PAl03、PA01遺傳關(guān)系較近，PAll與PA01遺傳關(guān)系最近，PAl、PA5、PA6與PAl03、PA01遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)，PAl2與PAl03、PA01遺傳關(guān)系相對遠(yuǎn)。通過toxA基因序列比較，可得知目前山東地區(qū)流行的水貂綠膿桿菌的有關(guān)外毒素A毒性的氨基酸均未發(fā)生突變，推斷菌株細(xì)胞毒沒有降低，且流行株變異不大。本試驗根據(jù)Geneba
6、nk上報道的綠膿桿菌ToxA基因序列設(shè)計引物，在引物的上下游分別帶有EcoRI、HindIII酶切位點。以本實驗室分離到的綠膿桿茵的染色體DNA為模板，經(jīng)PCR技術(shù)擴(kuò)增出約1917bp的片段，按常規(guī)方法克隆到pMD．18T裁體，經(jīng)藍(lán)白斑篩選和酶切分析獲得陽性重組質(zhì)粒，并提取質(zhì)粒。用相同的限制性內(nèi)切酶酶切表達(dá)載體pET32a和重組質(zhì)粒，構(gòu)建重組表達(dá)載體pET32a．ToxA，并轉(zhuǎn)入E．eoliDH5a中，得到基因工程菌，經(jīng)酶切扣測序鑒定證明克隆到載體pET32a上的外源基因即為綠膿桿茵的To)溘基因。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21中進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行S
7、DS．PAGE與Westernblot鑒定，可產(chǎn)生相對分子量約為78KDa青島農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文摘要的表達(dá)產(chǎn)物，表明成功地建立了外毒素A蛋白的重組表達(dá)系統(tǒng)。關(guān)鍵詞：水to；血清型；耐藥性；ToxA；原核表這Isolation，IdentificationandDrugResistanceDetectionofMinkPseudomonasaeruginosainShandongRegionandCloning，ExpressionofToxAGeneAbstractsFifteenisolatesofgram．nagativebacteriawereisola
