bcl-2蛋白高表達pc12細胞系的建立及其對酒精誘導細胞凋亡效應的研究

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1、河南大學碩士學位論文BCL--2蛋白高表達PC12細胞系的建立及其對酒精誘導細胞凋亡效應的研究姓名：王利枝申請學位級別：碩士專業(yè)：護理學指導教師：劉彬；殷明偉201206摘要目的克隆小鼠BCL一2基因全長cDNA，構建真核表達載體pcDNA3．1(．)．bcl-2，并建立高表達BCL．2蛋白的PCI2細胞，為研究BCL．2蛋白在酒精誘導PCI2細胞凋亡中的作用提供依據(jù)。方法從小鼠脾臟中提取總RNA，采用RT-PCR方法克隆BCL．2的cDNA，DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物并回收BCL．2基因。將全長BCL．2基因與pMD．19T載體連接，經(jīng)藍白斑篩選、克隆、轉(zhuǎn)化、提取質(zhì)粒

2、，經(jīng)PCR及菌液DNA測序鑒定，檢測BCL一2基因的準確性并檢測是否成功重組質(zhì)粒pMDl9一T-bcl-2。用HindlII和EcoRI兩種限制性內(nèi)切酶對質(zhì)粒pcDNA3．1(．)和重組質(zhì)粒pMDl9-T-bcl．2DNA進行酶切，切割產(chǎn)物經(jīng)1％的DNA瓊脂糖凝膠電泳分離后，用T4DNA連接酶將所需片段連接，轉(zhuǎn)化、克隆、提取細菌質(zhì)粒DNA，雙酶切鑒定確定真核表達載體pcDNA3．1(．)．bcl-2是否構建成功。采用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的方法將真核表達載體轉(zhuǎn)染至PCI2細胞，經(jīng)G418篩選，分別從PCI2細胞、轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3．1(．)的PCI2細胞和轉(zhuǎn)染了真核表達載體的PCI

3、2細胞提取細胞總RNA，采用RT-PCR的方法檢測細胞BCL．2基因mRNA的表達，應用Western．blot的方法檢測BCL．2蛋白的表達。MTT法測定不同濃度酒精(100mmoL／L、200mmoL／L、400mmoL／L)對三種PCI2細胞增殖的影響。結(jié)果從小鼠脾臟獲得較純的RNA，RT-PCR方法獲得到BCL一2基因產(chǎn)物。BCL一2基因和pMD．19T載體連接后，經(jīng)PCR和菌液測序證實，BCL一2基因正確且已和pMD．19T載體成功連接，得到重組質(zhì)粒pMDl9．T-bcl-2。雙酶切質(zhì)粒pMDl9．T-bcl．2和peDNA3．1(一)DNA并經(jīng)T4DNA連接酶

4、連接所需片段后，構建出真核表達載體pcDNA3．1(．)．bcl-2。從3種不同的PCI2細胞得到純度較高的RNA，經(jīng)RT-PCR和Western．blot分別檢測BCL．2mRNA和蛋白的表達，結(jié)果顯示成功建立了高表達BCL．2蛋白的PCI2細胞系。MTT結(jié)果表明，100mmol／L和200mmol／L酒精濃度時，BCL．2高表達的PCI2細胞組的生存率顯著高于對照組(尸O．05)。BCL．2蛋白在酒精濃度為100～200mmol／L范圍內(nèi)，對酒精誘導PCI2細胞的損傷及凋亡

5、的有保護作用。結(jié)論1．利用pMD．19TVector成功構建出pcDNA3．1(·)一6c，-2真核表達載體，轉(zhuǎn)染PCI2細胞后，表達高水平BCL．2mRNA和蛋白質(zhì)。2．高表達BCL．2的PCI2細胞能在一定濃度范圍內(nèi)抵抗酒精對細胞凋亡的誘導作用。關鍵字：酒精，BCL．2，克隆，轉(zhuǎn)染，PCI2細胞UABSTRACTobjective：WebuildthenuclearexpressesvectorofpcDNA3．1(一)-bcl-2withBCL一2cDNAcolonedfrommouse，thentransfectittOthePCI2cellandgetthePC

6、I2cellwithover-experssionBCL·2atlast,whichareusedforstudyingtheroleofBCL·2proteininalcohol—inducedapopotosisinthePC12cell．Methods：WeobtianthetotalRNAfrommousespleenandcolonethecDNAwhichreversetranscriptedfromthetotalRNA．obtaintheBCL一2DNAbyRT-PCRandthe1％DNAgelelectrophoresis．WelinktheBCL一2

7、tothepMD一19TVectorandextracttherestructuredDNAafterblue·whiteselecting，cloning，trans—forming．WedealwiththeDNAofpcDNA3．1(一)andpMD19-T-bcl-2whichhavebeentestedbyPCRandDNAsequencingusingtherestrictenzymesofH／ridIIIandEcoRIatthesametime，thenwelinktheneededfragmentswithT