bax蛋白穩(wěn)定高表達(dá)肝癌細(xì)胞的建立及其凋亡

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1、Bax蛋白穩(wěn)定高表達(dá)肝癌細(xì)胞的建立及其凋亡【關(guān)鍵詞】基因轉(zhuǎn)染關(guān)鍵詞:bax基因;癌，肝細(xì)胞;基因轉(zhuǎn)染;基因表達(dá)摘要:目的建立穩(wěn)定高表達(dá)Bax蛋白的肝癌細(xì)胞.方法用脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染法分別將含人baxcDNA的pBK-bax和pBK-CMV空載體質(zhì)粒導(dǎo)入人肝癌細(xì)胞系HCC-9204細(xì)胞中.經(jīng)G-418篩選獲得細(xì)胞克隆.ABC法和圖像定量分析檢測Bax蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)情況.HE染色觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化.TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡發(fā)生情況.結(jié)果轉(zhuǎn)染后用G-418篩選2echanismofproapoptoticgenebaxintheapoptot

2、icprocessofhepatocellularcarcinoma（HCC），andtoestablishtheHCCcellsidofbacteriophagueexpression　vectorpBK-bax，anbaxcDNA，idsofpBK-baxandemptyvectorpBK-CMVethod.Thepositivecellclones，ptyvec-tor，munocytochemicalABCmethodandimage-quantitativeanalysis.Themorphologicalchangesofthec

3、ellsethod.RESULTSTheagarosegelelectrophoresisindicatedthat，thereent，ptyvector，age-quantitativeanalysisafterim-munocytochemicalstainingindicatedthat，thereptyvectororuntransfectedHCC-9204cells.Thereorphologicalchangesofapopto-sis，suchascellpyknosis，circled，denselystainedandbu

4、b-bling，insomepBK-baxtransfectedcells，anditsTUNELin-dexptyvectororuntransfected.CONCLU┐SIONBaxgenecouldbetransfectedintoHCC-9204cellssuccessfully，andtheHCCcellsthatcanexpressBaxproteinstablyandhighlycouldbeobtained.TheapoptoticrateofbaxgenetransfectedHCC-9204cellsincreasess

5、ignificantly.　　0引言　　Bax是目前細(xì)胞凋亡研究中較為熱門的促凋亡基因，屬于細(xì)胞凋亡相關(guān)基因bcl-2家族.在多數(shù)情況下轉(zhuǎn)染bax基因不僅能夠使細(xì)胞生長受到抑制，而且能夠促進(jìn)多種因素誘導(dǎo)的多種細(xì)胞的凋亡［1-4］.關(guān)于轉(zhuǎn)染bax基因?qū)υl(fā)性肝細(xì)胞癌（簡稱肝癌）細(xì)胞凋亡的影響及其作用機(jī)制尚未見報(bào)道.免疫細(xì)胞化學(xué)檢測顯示，HCC-9204是一株Bax蛋白表達(dá)相對較低的肝癌細(xì)胞系.我們用基因轉(zhuǎn)染法把bax基因?qū)敫伟┘?xì)胞系HCC-9204細(xì)胞中，建立穩(wěn)定高表達(dá)Bax蛋白的肝癌細(xì)胞，并對其凋亡現(xiàn)象進(jìn)行觀察，為研究有關(guān)bax基因在肝癌細(xì)

6、胞凋亡調(diào)控中的作用奠定基礎(chǔ).　　1材料和方法　　1.1材料插有正向人baxcDNA（576bp）的pBK-bax噬菌粒表達(dá)載體菌種為本校免疫學(xué)教研室劉飛博士惠贈(zèng).pBK-CMV空載體質(zhì)粒為上海第二醫(yī)科大學(xué)司曉輝博士惠贈(zèng).人肝癌細(xì)胞系HCC-9204為本室建立，用含有150mL・L-1新生牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液在50mL・L-1CO2條件下培養(yǎng).INE和G-418為美國Gibco公司產(chǎn)品.鼠抗人Bax蛋白mAb為美國Oncogene公司產(chǎn)品.免疫組化ABC試劑盒為美國Vector公司產(chǎn)品.末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶

7、介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記（TUNEL）法凋亡檢測試劑盒為德國BoehringerMannheim公司產(chǎn)品.　　1.2方法　　1.2.1pBK-bax載體的鑒定pBK-bax菌種經(jīng)鋪板活化后挑取單克隆菌株置于含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃振搖12h.用INE將pBK-bax質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入HCC-9204細(xì)胞，同時(shí)設(shè)轉(zhuǎn)染pBK-CMV空載體質(zhì)粒和不轉(zhuǎn)染的HCC-9204細(xì)胞對照.3d后換用含有500mg・L-1G-418的新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，2～3L・L-1乙醇固定15min.分別經(jīng)3mL・L-1H2O2

8、和3mL・L-1TritonX-100處理后，加正常羊血清，37℃，30min.加鼠抗人BaxmAb，37℃，1h.加生物素化的羊抗鼠IgGmAb，3