bnip3在鎘神經(jīng)毒性中的作用及分子機(jī)制研究

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1、南方醫(yī)科大學(xué)2011級(jí)碩士學(xué)位論文BNIP3在鎘神經(jīng)毒性中的作用及分子機(jī)制研究MolecularmechanismofBNIP3inCadmium—inducedneurotoxicity課題來(lái)源：國(guó)家自然科學(xué)資金：81101611國(guó)家自然科學(xué)資金：81272180國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)分題2012CB518200專(zhuān)業(yè)名稱(chēng)勞動(dòng)衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學(xué)學(xué)位申請(qǐng)人蕭嘉麗指導(dǎo)教師鄒飛教授答辯委員會(huì)主席答辯委員會(huì)成員論文評(píng)閱人余El安教授董軍教授陳雪梅教授蔡春青教授李文軍副教授董軍教授孟曉靜教授2014年5月20號(hào)廣州碩士學(xué)位論文

2、BNIP3在鎘神經(jīng)毒性中的作用及分子機(jī)制研究碩士研究生：蕭嘉麗指導(dǎo)教授：鄒飛教授摘要背景鎘(Cadmium，Cd)是一種高度毒性的重金屬，主要來(lái)源于冶煉、石油燃燒、工業(yè)廢物、金屬澄清劑以及香煙等。除職業(yè)工人外，普通居民因污染的水、空氣和土壤而日益成為潛在的接觸人群。Cd能引起癌癥、腎和生殖功能障礙，以及神經(jīng)功能紊亂。Cd暴露可引起兒童的學(xué)習(xí)障礙。成人Cd作業(yè)者可表現(xiàn)出神經(jīng)性缺陷如心理反應(yīng)速度減慢：同時(shí)工人主訴平衡能力下降和注意力減退。Cd誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性包括細(xì)胞死亡、神經(jīng)生物化學(xué)改變(神經(jīng)遞質(zhì)和受體)和生理／行為的改變。Cd可造成兩

3、種形式的細(xì)胞死亡：caspase依賴(lài)的凋亡和caspase不依賴(lài)的壞死樣死亡。文獻(xiàn)報(bào)道，Cd能誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞同時(shí)發(fā)生凋亡及壞死樣死亡。Cd通過(guò)復(fù)雜的信號(hào)通路誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞死亡，包括：氧化應(yīng)激，MAPKs(Mitogen—activatedproteinkinases)和mTOR的激活。然而在Cd誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞死亡中，凋亡及壞死樣死亡的作用仍不清楚。此外，Cd誘導(dǎo)的壞死樣死亡的分子機(jī)制仍然未知。BNIP3蛋白(Bcl一2andadenovirusE1B一19kDa—interactingprotein3)，是Bcl一2蛋白家族中BH3-

4、only亞家族的一員，在細(xì)胞死亡中發(fā)揮重要作用。BNIP3廣泛涉及多個(gè)病理過(guò)程，例如心肌肥大和萎縮、腫瘤形成和神經(jīng)系統(tǒng)缺氧／缺血。最新的研究發(fā)現(xiàn)BNIP3與神經(jīng)退行性疾病亨廷頓氏病(Huntington’S摘要Disease，HD)密切相關(guān)，在HD病人的肌肉細(xì)胞及HD動(dòng)物模型的腦組織中均檢出BNIP3的異常積聚。當(dāng)前，越來(lái)越多的研究結(jié)果表明BNIP3參與caspase不依賴(lài)的細(xì)胞死亡。此外，有研究顯示某些毒素如氰化物和鈷(Cobalt，Co)能誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)BNIP3，且BNIP3參與這些毒素誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。然而，Cd誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性

5、中BNIP3是否發(fā)揮同樣的作用未見(jiàn)報(bào)道。MAPKs是Cd誘導(dǎo)神經(jīng)毒性中的重要分子。MAPKs由絲氨酸一蘇氨酸激酶級(jí)聯(lián)放大信號(hào)組成。哺乳類(lèi)動(dòng)物的MAPKs家族包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)，p38和c—JunNH2端激酶(JNK)。很多研究表明MAPKs參與神經(jīng)炎癥反應(yīng)和神經(jīng)變性過(guò)程。盡管MAPKs對(duì)Cd誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性有著重要作用，但其下游分子仍然未知。目的本研究通過(guò)聯(lián)合使用多種細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，如RNA干擾、qRT—PCR、蛋白免疫印跡、臺(tái)盼藍(lán)排斥法和PI染色等，探討B(tài)NIP3在cd誘導(dǎo)神經(jīng)毒性中的作用和分子機(jī)制。

6、方法L我們選擇SH-SY5Y和PCI2細(xì)胞為研究對(duì)象。采用臺(tái)盼藍(lán)排斥法檢測(cè)不同Cd濃度條件下神經(jīng)細(xì)胞的死亡率。2．cd處理細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)后使用免疫印跡法檢測(cè)caspase-3和PARP蛋白的表達(dá)。預(yù)先使用pan—caspase抑制劑(zVAD-fmk)或兩個(gè)壞死抑制劑(Necrox一2和Necrox一5)處理神經(jīng)細(xì)胞，然后加入Cd處理神經(jīng)細(xì)胞12h。通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染色及檢測(cè)培養(yǎng)基中乳酸脫氫酶(LDH)含量，計(jì)算各組死亡率。3．分別使用qRT—PCR和免疫印跡，檢測(cè)Cd處理的神經(jīng)細(xì)胞BNIP3基因和蛋白的表達(dá)。4．通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染化學(xué)合成的

7、siRNA，下調(diào)BNIP3表達(dá)。RNAi下調(diào)BNIP3表達(dá)后，II碩士學(xué)位論文Cd處理神經(jīng)細(xì)胞24h。通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)排斥法檢測(cè)Cd誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡率；通過(guò)共聚焦顯微鏡檢測(cè)并計(jì)算PI陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)；檢測(cè)培養(yǎng)基中LDH含量。5．分別使用Cd或Co處理神經(jīng)細(xì)胞，通過(guò)免疫印跡檢測(cè)HIF一1Q蛋白的表達(dá)，通過(guò)qRT—PCR檢測(cè)血管內(nèi)皮生成因子(Vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)基因的表達(dá)。6．使用免疫印跡檢測(cè)cd處理細(xì)胞不同時(shí)間的MAPKs激活情況。7．預(yù)先使用MEK(ERK的上游激酶)抑制劑U0126、JNK

8、抑制劑SP600125或p38抑制劑SB203580處理細(xì)胞30分鐘，然后加入Cd處理神經(jīng)細(xì)胞24h。使用免疫印跡檢測(cè)BNIP3蛋白的表達(dá)及caspase一3的活化，通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)排斥法檢測(cè)細(xì)胞死亡率。8．構(gòu)建小鼠Cd染毒模型。將20只雄性BALB／c