β防御素1基因單核苷酸多態(tài)性與膿毒癥發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性研究

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1、浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文6防御素，基因單核苷酸多態(tài)性與膿毒癥發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性研究浙江文學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鄒逸夫醫(yī)院研究生呂晨導(dǎo)師方向明最投中文捕要研究背景膿毒癥(sepsis)系微生物入侵機(jī)體感染后所致的全身性炎癥反應(yīng)綜合征(systemicinflammatoryresponsesyndrome,SIRS)，機(jī)體促炎癥反應(yīng)和抗炎癥反應(yīng)間的不平衡及免疫功能的失調(diào)和凝血纖溶系統(tǒng)的異常是其發(fā)生、發(fā)展的病理生理基礎(chǔ)。重癥膿毒癥(severesepsis)、膿毒性休克(septicshock)及多器官功能障礙綜合征(multipleorgandysfunctionsyndrome。M

2、ODS)是膿毒癥的后續(xù)癥。膿毒癥是重癥監(jiān)護(hù)病房(ICU)中高發(fā)及高致死率的主要疾病，它是一種環(huán)境因素(病源微生物)和遺傳因素共同作用的多基因病，多個(gè)常見(jiàn)的、微效的遺傳變異獨(dú)立或相互問(wèn)通過(guò)目前尚未能闡明的分子機(jī)制在膿毒癥的發(fā)生、發(fā)展中起著一定的作用，不同個(gè)體對(duì)膿毒癥的易感性和預(yù)后存在明顯的差異，這種個(gè)體間的基因背景差異和基因多態(tài)性，影響了個(gè)體對(duì)感染及創(chuàng)傷所致的系統(tǒng)性炎癥應(yīng)答反應(yīng)。基因決定著各種炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子的合成和釋放，以往的研究提示編碼炎癥介質(zhì)和纖溶凝血分子基因的多態(tài)性可能是膿毒癥及MODS的高危預(yù)警標(biāo)識(shí)。浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文天然免疫系統(tǒng)在膿毒癥的發(fā)生、發(fā)展中起

3、著重要作用，在人呼吸道上皮中具有天然免疫活性的陽(yáng)離子多肽分子主要是人B防御素(humanbetadefensin。DEFB)和LL．37。DEFB是一類(lèi)具有抗菌活性的陽(yáng)離子多肽，它具有廣譜的抗微生物活性的同時(shí)又具有某些免疫調(diào)節(jié)作用，如對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞及T細(xì)胞有趨化作用。DEFBl是最早發(fā)現(xiàn)的DEFB，研究發(fā)現(xiàn)DEFBl在皮膚及多種上皮組織中均有表達(dá)，它在呼吸道黏膜的抗微生物過(guò)程中起著重要作用。DEFBl的基因定位于8號(hào)染色體，p23區(qū)，在對(duì)五類(lèi)人種DEFBl基因的研究中共發(fā)現(xiàn)了15個(gè)單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphisms，SNPs)，

4、其ae7個(gè)SNP在不同人種中等位基因頻率存在明顯差異。盡管DEFBl是組成型表達(dá)的，但已有研究表明DEFBl基因中SNP與某些疾病存在相關(guān)性，5’非編碼區(qū)的SNP與兒童mV病毒感染、哮喘和遺傳性過(guò)敏癥存在相關(guān)性，而一44C／G可能與口腔黏膜假絲單胞菌感染關(guān)聯(lián)，1654A／G是一個(gè)第二外顯子非同義突變，曾報(bào)道日本COPD患者中等位基因G的頻率高達(dá)8％，但DEFBl基因多態(tài)性是否與膿毒癥的發(fā)生和預(yù)后存在相關(guān)性，至今仍無(wú)相關(guān)報(bào)道。研究目的通過(guò)病例一對(duì)照關(guān)聯(lián)研究，探討DEFBl基因單核苷酸多態(tài)性與膿毒癥的易感性、肺損傷的嚴(yán)重程度及預(yù)后是否存在相關(guān)性，進(jìn)而尋找有效的膿毒癥相關(guān)

5、基因標(biāo)識(shí)。浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文方法本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者知情同意后，由本人或直系親屬簽字后進(jìn)行。膿毒癥患者268例，均符合1992年和2001年美國(guó)胸科醫(yī)師協(xié)會(huì)及危重病學(xué)會(huì)制定的膿毒癥診斷標(biāo)準(zhǔn)的病人，排除孕婦及年齡小于18歲的患者。疾病嚴(yán)重程度采用急性生理學(xué)及慢性健康評(píng)分(腳)AC鼬II)和膿毒癥相關(guān)器官衰竭評(píng)分(Sepsis—relatedOrganFailureAssessmentScore)(SOFA)，呼吸系統(tǒng)損傷程度以氧合指數(shù)(OI)表示。對(duì)照組157例，為同期擇期手術(shù)后未并發(fā)膿毒癥的病人。抽取外周靜脈血10ml，以2％乙二胺四乙酸二鈉(EDTA

6、)抗凝，移取200pl全血用QIAampDNABloodMiniKit(QIAGEN公司)提取基因組DNA。將提取的基因組DNA溶于200plTE緩沖液中置．800C冰箱保存。聚合酶聯(lián)反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增DNA片段及DNA直接測(cè)序一1816A／G(rs2741136)、·52A／G(rsl799946)、-44C／G(rsl800972)、．20A／G(rsl1362)的測(cè)定采用PCR擴(kuò)增DNA片段后DNA直接測(cè)序的方法。隨機(jī)抽取30例標(biāo)本，采用限制性酶切分析驗(yàn)證結(jié)果的準(zhǔn)確性。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)雙引物等位基因特異性擴(kuò)增'法(PCR-ASA)．390J岍(m2738182)

7、檢測(cè)采用PCR-ASA的方法，分別設(shè)計(jì)兩條上游引物，引物的3’端首個(gè)堿基恰好分別結(jié)合．390A／T多態(tài)位點(diǎn)的A和T，其余序列相同，同時(shí)設(shè)計(jì)兩條不同的下游引物。每一標(biāo)本均用兩對(duì)引物分別擴(kuò)增，將兩次擴(kuò)增PCR產(chǎn)物混合勻后抽取8姐l于2％瓊脂糖凝浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文膠(O．25la咖l溴化乙錠)電泳(90V,40min)，置于紫外成像儀下分析：M～純合在408bp處呈現(xiàn)一條亮帶，A／T雜合分別在408bp、263bp處有兩條亮帶，1仃純合在263bp處呈現(xiàn)一條亮帶，隨機(jī)抽取30個(gè)標(biāo)本進(jìn)行直接測(cè)序，兩種檢測(cè)結(jié)果均吻合。TaqMan檢測(cè)SNP1654G／A(rs27380