骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化及大鼠間異體移植的研究

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1、河北醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化及大鼠間異體移植的研究姓名：李松申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：外科學(xué)指導(dǎo)教師：邱建宏201203中文摘要骨髓間充質(zhì)千細(xì)胞向成肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化及大鼠間異體移植的研究。摘要目的：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)具有向成肌細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、成脂細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞等多種成熟細(xì)胞分化的潛能，其來(lái)源豐富，分離、培養(yǎng)較為容易，在體外可多次擴(kuò)增，自體移值不俘在組織配型及免疫排斥的問(wèn)題。由于MSCs具有上述優(yōu)點(diǎn)，使其引起了廣泛的關(guān)注，尤其是組織修復(fù)方面，可將其應(yīng)用于器官及組織的修復(fù)治療中。本

2、實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究骨髓問(wèn)充質(zhì)干細(xì)胞在不同條件下分離、純化、傳代、鑒定及誘導(dǎo)，得出培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的最佳培養(yǎng)條件。并進(jìn)一步用5一氮雜胞苷(5-Aza—CR)誘導(dǎo)其向成肌細(xì)胞分化，將誘導(dǎo)后的干細(xì)胞用BrdU標(biāo)定，移值入SD大鼠膀胱肌層，觀察其在膀胱肌層的存活及分布狀況。方法：(1)MSCs的分離培養(yǎng)(2)MSCs的鑒定(3)MSCs的傳代培養(yǎng)(4)不同種植密度對(duì)MSCs生長(zhǎng)的影響(5)不同濃度胎牛血清對(duì)MSCs生長(zhǎng)的影響(6)傳代細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線(7)5-Aza．CR誘導(dǎo)MSCs分化為成肌細(xì)胞(8)MSCs受5-Aza．CR誘導(dǎo)后肌

3、分化相關(guān)蛋白的表達(dá)(9)BrdU轉(zhuǎn)染及鑒定(10)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞異體移植結(jié)果：(1)MSCs的分離培養(yǎng)脫頸處死6周齡SD大鼠1只，75％酒精浸泡5rain滅菌，取出大鼠雙側(cè)脛骨及股骨，剪去長(zhǎng)骨兩端，暴露骨髓腔，5ml注射器反復(fù)沖洗得到單細(xì)胞：懸液，移入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。根據(jù)MSCs與雜質(zhì)細(xì)胞的貼壁時(shí)間差純化干細(xì)胞，鏡下可見(jiàn)細(xì)胞開(kāi)始貼壁變形，原代干細(xì)胞呈圓形、三角形、多角形，雜質(zhì)細(xì)胞形態(tài)呈圓形或不貼壁。培養(yǎng)48h后，顯微鏡下觀察可見(jiàn)貼壁細(xì)胞數(shù)量明顯增多，部分呈集落樣生長(zhǎng)。培養(yǎng)4～6d后，貼壁細(xì)胞分裂增殖明顯，可見(jiàn)較多的分裂相，隨

4、著細(xì)胞數(shù)目增多，二維生長(zhǎng)的干細(xì)胞群內(nèi)空間趨于狹窄，故出現(xiàn)漩渦樣，成纖維樣細(xì)胞集落。(2)MSCs的鑒定對(duì)干細(xì)胞的鑒定仍然是一個(gè)難題，目前尚無(wú)統(tǒng)～的、權(quán)威的標(biāo)準(zhǔn)。目前的現(xiàn)狀是，大多數(shù)人采用聯(lián)合應(yīng)用多種抗體分離鑒定MSCs，一般采用排除法或推逆法對(duì)其進(jìn)行鑒定。目前最常用的間充質(zhì)干細(xì)胞陽(yáng)性標(biāo)記物有：SH．2、SH．3、SH．4、CD29、CD44、中文摘要CD54、CD73、CDl05、CDl667孛；陰仨}標(biāo)’}己物有：CDl4、CD34、CD45、CD34、CD3l、V岍等，本實(shí)驗(yàn)選擇CD29，CD44作為陽(yáng)性標(biāo)記物，CD34

5、，CD45作為陰性標(biāo)記物，以免疫組化法檢測(cè)細(xì)胞特異性抗原。(3)MSCs傳代培養(yǎng)10．14天，細(xì)胞密度逐步增加，融合成片。傳代接種后的細(xì)胞分布均勻，以梭狀為主。傳l、2代的MSCs形態(tài)均一，呈長(zhǎng)梭形，雜質(zhì)細(xì)胞隨傳代、換液逐漸減少。培養(yǎng)至傳P8(傳八代)細(xì)胞，干細(xì)胞仍然存活，但細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，形態(tài)開(kāi)始變化，折光性較差，殲始脫壁凋亡。(4)不同種植密度對(duì)MSCs生長(zhǎng)的影響在106／ml密度接種時(shí)MTT比色法檢測(cè)OD490值最大，活細(xì)胞數(shù)量多，細(xì)胞活性較好，較利于MSCs的生長(zhǎng)。(5)不同濃度胎牛血清對(duì)MSCs生長(zhǎng)的影響在10％一-

6、15％的胎牛血清濃度時(shí)MTT比色法檢測(cè)OD490最高，證明10％'---15％血清濃度最適膏：MSCs生長(zhǎng)。(6)傳代細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線細(xì)胞生長(zhǎng)曲線呈S形，增殖包括滯留期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、平臺(tái)期三個(gè)時(shí)期，PI(傳-i-℃)細(xì)胞增殖較快，其速度明顯快于其他時(shí)期。(7)5-Aza．CR誘導(dǎo)MSCs最適濃度測(cè)定及誘導(dǎo)效果不同濃度5-Aza．CR誘導(dǎo)MSCs，在lOumol／L的濃度時(shí)MTT比色法檢測(cè)OD490最高，證明10umol／L5-Aza—CR濃度最適宜MSCs誘導(dǎo)。以lOumol／L5-Aza．CR誘導(dǎo)傳MSCs，4d后未發(fā)現(xiàn)干細(xì)

7、胞胞體明顯變化，10d見(jiàn)小部分細(xì)胞胞體增大、變長(zhǎng)，13d可見(jiàn)部分細(xì)胞相互接觸，至15d一17d可見(jiàn)有類肌管樣結(jié)構(gòu)出現(xiàn)。(8)MSCs受5．Aza．CR誘導(dǎo)后肌分化相關(guān)蛋白的表達(dá)誘導(dǎo)后的細(xì)胞4d檢測(cè)，未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞表達(dá)肌細(xì)胞特異抗原，誘導(dǎo)后的細(xì)胞12d后，細(xì)胞表達(dá)desmin(結(jié)蛋白)明顯呈陽(yáng)性，5-Aza—CR誘導(dǎo)后14d表達(dá)myosin(肌動(dòng)蛋白重鏈)程度明顯呈陽(yáng)性。(9)BrdU轉(zhuǎn)染及餐定在傳3代干細(xì)胞中加入含BrdU40lag／ml標(biāo)記培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染48h，觀察可見(jiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)良好，懸浮死亡細(xì)胞較少，進(jìn)一步鋪片以免疫組化法檢測(cè)轉(zhuǎn)

8、染情況，可見(jiàn)部分細(xì)胞核呈棕黃色，說(shuō)明轉(zhuǎn)染成功。(10)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞異體移植將誘導(dǎo)后的于細(xì)胞用BrdU標(biāo)定，手術(shù)直視下移植入大鼠膀胱內(nèi)，4周后取出大鼠膀胱，以免疫組化法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，移植細(xì)胞在活體大鼠膀胱內(nèi)可繼續(xù)生存且分布均勻。結(jié)論：(1)骨髓提取培養(yǎng)后得到的不是單一種類細(xì)胞，骨髓間充質(zhì)干細(xì)