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1、華中農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文盾殼霉產(chǎn)孢相關(guān)基因Cm1107的功能研究姓名：陳雪申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：植物病理學(xué)指導(dǎo)教師：姜道宏201206華中農(nóng)業(yè)大學(xué)2012屆碩士畢業(yè)論文摘要盾殼霉(Coniothyriumminitans)是植物病原真菌核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum)的重寄生真菌。在前期，實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建了盾殼霉ZS．1菌株的T-DNA標(biāo)記插入突變體庫(含30500個(gè)突變體)，其中ZS．1T2029是產(chǎn)孢缺陷型突變體。通過抑制性差減雜交(SSH)的方法，獲得一些在盾殼霉產(chǎn)孢時(shí)期表達(dá)上調(diào)的表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)。本文在實(shí)驗(yàn)室前期研究基礎(chǔ)上，通過反向遺
2、傳學(xué)的方法，對(duì)其中一個(gè)表達(dá)上調(diào)的基因Cmll07進(jìn)行了初步研究，研究結(jié)果如下：通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)Cmll07基因?yàn)閱慰截?，全長1395bp，具有2個(gè)外顯子，1個(gè)內(nèi)含子(64bp)。Blastx分析發(fā)現(xiàn)該基因與堿性螺旋．環(huán)．螺旋(basicHelix．100p．helix，bHLH)轉(zhuǎn)錄因子相似性最高，該基因產(chǎn)物3’-端含有螺旋-環(huán)-螺旋(HLH)結(jié)構(gòu)域(cd00083)。轉(zhuǎn)錄因子bHLH超家族包含大量參與發(fā)育相關(guān)過程的一系列蛋白，這些蛋白都擁有一段堿性區(qū)域(basicregion)和HLH結(jié)構(gòu)域。在其他真菌中，已經(jīng)有一些研究證明bHLH轉(zhuǎn)錄因子與真菌有性和無性孢子
3、的發(fā)育相關(guān)。RT-PCR結(jié)果表明Cmll07基因在盾殼霉生長發(fā)育的各階段均表達(dá)，且在孢子萌發(fā)階段的表達(dá)量最高。根據(jù)同源重組原理構(gòu)建了基因敲除載體，通過采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化(朋MT)盾殼霉孢子的方法，獲得了3個(gè)Cmll07基因的敲除轉(zhuǎn)化子(K01107)。在PDA上培養(yǎng)時(shí)，K01107與野生菌株ZS．1相比在生長速度、菌絲形態(tài)等方面均無顯著變化。但K01107中許多孢了的形態(tài)較大，這種異常的孢子所占比例超過16％，而ZS-l巾異常孢子的比例小于2％。K01107在菌落表面產(chǎn)生的孢子與ZS．1相比顯著降低，但在菌絲塊內(nèi)部產(chǎn)生的孢子與ZS一1無顯著差異。與核盤菌菌株1980對(duì)
4、峙培養(yǎng)時(shí)，ZS．1的孢子能跨越菌絲接觸區(qū)在核盤菌菌絲上形成黑色的分生孢子器，而KOll07在菌絲交界處無法產(chǎn)孢。在寄生核盤菌Ep．1PNA367菌核時(shí)，ZS．1在菌核表面形成大量分生孢子器，而K01107只能產(chǎn)生少量的分生孢子器。此外，KOll07寄生菌核能力與ZS．1相比顯著下降。同時(shí)我們成功構(gòu)建了Cmll07基因的超表達(dá)載體，并獲得了超表達(dá)轉(zhuǎn)化子(OEll07)，后續(xù)研究仍在進(jìn)行中。研究結(jié)果初步表明Cmll07基因?qū)Χ軞っ巩a(chǎn)孢有一定的調(diào)控作用，這將有助于我們進(jìn)一步闡明盾殼霉產(chǎn)孢相關(guān)的信號(hào)途經(jīng)。關(guān)鍵詞：盾殼霉；重寄生真菌；核盤菌；堿性螺旋．環(huán)一螺旋；轉(zhuǎn)錄因子ABST
5、RACTConiothyriumminitansisanimportantbiocontrolagentofrapeseedstemrotcausedby＆尼rotiniasclerotiorum，whichiSdistributedworldwide．AT-DNAinsertionaIlibrary謝th30500mutants，ofwhichZS-1T2029iSamutantdeficientinconidiation．wasconstructedinourlab．SomeESTswhoseexpressionswereupregulatedwasditecte
6、dthroughsuppressionsubtractivehybridization(SSH)．Inthisresearch,Cmll07,relatedwithconidiationofCminitans，waspreliminarilystudiedthroughreversedgeneticmethodsonthebasisofpriorresearch．Theresultswereasfollowed：ByanalyzingthegenomesequenceofCminitans晰t11bioinformaticmethods，itrevealedC瓏JJD
7、7gene，a1395bpfragment麗mtwoexonsandoneintron(64bp)，hadasinglecopyinthegenome．SequenceanalysisthroughblastxshowedCmll07hadhighidentitywithbasicHelix-loop—helix(bHLH)transcriptionfactor,what。Smore，3’endofCmll07containedHelix—loop-helix(HLH)domain(cd00083)．ThebHLHtranscriptionfacto
