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1、蘭州大學(xué)碩士學(xué)位論文人rhoC基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建及其表達(dá)姓名：王燕玲申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：生物物理學(xué)指導(dǎo)教師：王勤20050501原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：本人所呈交的學(xué)位論文，是在導(dǎo)師的指導(dǎo)下獨(dú)立進(jìn)行研究所取得的成果。學(xué)位論文中凡引用他人已經(jīng)發(fā)表或未發(fā)表的成果、數(shù)據(jù)、觀點(diǎn)等，均已明確注明出處。除文中已經(jīng)注明引用的內(nèi)容外，不包含任何其他個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的科研成果。對(duì)本文的研究成果做出重要貢獻(xiàn)的個(gè)人和集體，均已在文中以明確方式標(biāo)明。本聲明的法律責(zé)任由本人承擔(dān)。論文作者簽名：燃日期：絲：!：』關(guān)于學(xué)位論文使用授權(quán)的聲明本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下所完成的論文及相關(guān)的職務(wù)作品，
2、知識(shí)產(chǎn)權(quán)歸屬蘭州大學(xué)。本人完全了解蘭州大學(xué)有關(guān)保存、使用學(xué)位論文的規(guī)定，同意學(xué)校保存或向國(guó)家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的紙質(zhì)版和電子版，允許論文被查閱和借閱；本人授權(quán)蘭州大學(xué)可以將本學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，可以采用任何復(fù)制手段保存和匯編本學(xué)位論文。本人離校后發(fā)表、使用學(xué)位論文或與該論文直接相關(guān)的學(xué)術(shù)論文或成果時(shí)，第一署名單位仍然為蘭州大學(xué)。保密論文在解密后應(yīng)遵守此規(guī)定。論文作者簽名：型啦導(dǎo)師簽名日期：超§：f蘭州大學(xué)碗：t研究生學(xué)位論文人_rhoC基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建及其表達(dá)摘要近年研究發(fā)現(xiàn)Rho蛋白家族成員RhoC在腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程中起重要作用，可能
3、是腫瘤轉(zhuǎn)移的分子開關(guān)。為研究RhoC蛋白和其他蛋白質(zhì)的相互作用，更好的理解RhoC在腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移過程中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，我們構(gòu)建了含全長(zhǎng)rhoC編碼eDNA的原核表達(dá)載體，在大腸桿菌中表達(dá)GST—RhoC融合蛋白，為該基因的體外GST．pulldown實(shí)驗(yàn)及免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)作準(zhǔn)備。目的：構(gòu)建人拍以基因的原核表達(dá)載體，體外誘導(dǎo)表達(dá)GST—RhoC融合蛋白及表達(dá)產(chǎn)物的純化。方法：從新鮮人直腸癌組織中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，以此eDNA為模板經(jīng)PCR擴(kuò)增目的片段，連接到pMDl8一T載體。測(cè)序結(jié)果正確后，再連接到表達(dá)載體pET42，IPTG誘導(dǎo)GST—RhoC表
4、達(dá)并用親和層析方法純化。結(jié)果：DNA測(cè)序結(jié)果證明用RT2PCR擴(kuò)增得到了全長(zhǎng)rhoC基因編碼序列：經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切圖譜分析證明rhoC被重組到表達(dá)載體中；用SDS．PAGE證明經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后在體外成功表達(dá)了GST．RhoC融合蛋白。結(jié)論：成功構(gòu)建了人rhoC基因原核表達(dá)載體，并進(jìn)行了體外表達(dá)。關(guān)鍵詞：rhoCRT．PCR基因重組原核表達(dá)融合蛋白蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文ConstructionofhumanrhoCgenevectoranditsexpressioninEscherichiacoilA、bstractLotsofstudiesdemonstrateect
5、opicoverexpressionofRhoCincreasesthetumorigenicandmetastaticpropertiesoftumorprogenitorcells．RhoCmaybeamolecularswitchtoregulatemetastasisoftumorcellToinvestigatetheinteractionbetweenRhoCandotherproteinswithGST—pulldownandimmunoprecipitation，andtoelucidatethemechanismofinducinginvasionandm
6、etastasisoftumorcellbyRhoC，weconstructtherecombinantvectorpET42-humanrhoCandexpresstherecombinantproteininEscherichiacoli．0bjeetive：ToconstructtherecombinantvectorpET42一humanrhoCandexpresstherecombinantproteininEcoli．Methods：First．rectumtumortissuewasusedtoextracttotalRNA．Second，thefirst—s
7、trandofcDNAwassynthesizedbyM—MLVreversetranscriptase．Third，PCRwasusedtoampli對(duì)humanrhoCgene，which‘wasinsertedintopMDt8一Tvectorandthensequenced；RightrecombinantplamsidwasdigestedwithtwodifferentrestrictedenzymesandinsertedintopET42toconstructprokaryoticexpressio
