壓瘡大鼠骨骼肌組織inos的表達(dá)及血清中no、sod、mda變化的觀察

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1、中國(guó)醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文壓瘡大鼠骨骼肌組織iNOS的表達(dá)及血清中NO、SOD、MDA變化的觀察姓名：臧爽申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專(zhuān)業(yè)：發(fā)育生物學(xué)指導(dǎo)教師：翟秀巖20090401·中文論著摘要·壓瘡大鼠骨骼肌組織iNOS的表達(dá)及血清中NO、SOD、MDA變化的觀察目的壓瘡(pressureulcer，PU)是臨床常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，也是治療和護(hù)理的難題，一旦發(fā)生，不僅增加患者的痛苦，加重原發(fā)疾病，延長(zhǎng)病程，嚴(yán)重可因繼發(fā)感染而危及生命。其形成是多因素參與的復(fù)雜過(guò)程，其中壓力是發(fā)生壓瘡最重要的危險(xiǎn)因素，局部組

2、織受壓引起毛細(xì)血管血流不暢，血液回流受阻，進(jìn)而導(dǎo)致組織的供氧和營(yíng)養(yǎng)缺乏，當(dāng)受壓組織恢復(fù)血液灌流后又發(fā)生缺血再灌注損傷(ischemiareperfusioninjury，IRI)。雖然目前對(duì)腦以及心肌等缺血再灌注損傷的研究較為深入，但迄今為止，壓瘡骨骼肌的缺血再灌注損傷的機(jī)制尚不十分明確，因此闡明壓瘡發(fā)生缺血再灌注損傷的機(jī)制，探討有針對(duì)性的防治措施，減輕或避免缺血再灌注損傷的發(fā)生，是防治壓瘡的關(guān)鍵。在壓瘡的缺血再灌注期，受壓組織大量釋放的自由基會(huì)加重組織損傷，因此對(duì)自由基的檢驗(yàn)可以驗(yàn)證缺血再灌注

3、損傷的發(fā)生以及嚴(yán)重程度。一氧化氮合酶(nitricoxidesynthase，NOS)是內(nèi)源性生物合成酶，依據(jù)NOS基因在染色體上的定位不同，分為3種亞型：神經(jīng)元型一氧化氮合酶(neuronalNOS，nNOS)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducibleNOS，iNOS)、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(edothelialNOS，eNOS)。其中nNOS和eNOS又稱(chēng)為結(jié)構(gòu)型NOS(constitutivenitricoxidesynthase，c：NOS)其表達(dá)依賴(lài)Ca+和鈣調(diào)蛋白(CAM)，是骨骼肌在生

4、理狀態(tài)下存在并表達(dá)的酶，由其產(chǎn)生的一氧化氮(nitricoxide，NO)主要發(fā)揮神經(jīng)遞質(zhì)和第二信使作用；iNOS是在損傷、缺血、炎癥介質(zhì)、內(nèi)毒素等病理因素的刺激下被激活，其活性不依賴(lài)Ca+和CaM，合成大量具有細(xì)胞毒性作用的NO，參與介導(dǎo)免疫反應(yīng)，可引起細(xì)胞和組織的損傷。組織缺血缺氧后，線粒體合成ATP減少，ATP依賴(lài)的離子泵衰竭，細(xì)胞內(nèi)鈣超載，黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)活化，花生四烯酸所引起的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)激活，產(chǎn)生大量的自由基。NO也稱(chēng)氮氧自由基，可以通過(guò)多條通路參與缺血再灌注損傷的發(fā)生；超氧化物岐化酶(

5、superoxidedismutase，SOD)是體內(nèi)重要的過(guò)氧化物酶，能及時(shí)清除可能產(chǎn)生的氧自由基，保護(hù)細(xì)胞免受氧化性損傷，其活性可反映機(jī)體清除氧自由基的能力；丙二醛(malondialdehyde，MDA)是氧自由基作用于生物膜多聚不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，其產(chǎn)生量與氧自由基的量相平衡，因而測(cè)定其含量可以反映組織中含有氧自由基的水平和組織內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化的情況。研究資料表明缺血再灌注損傷參與壓瘡的形成，但壓瘡形成過(guò)程中自由基的產(chǎn)生機(jī)制及其在壓瘡形成過(guò)程中的作用尚不清楚。為此，本研究采

6、用外加物理壓力作用于大鼠肢體復(fù)制大鼠壓瘡模型，觀察肢體受壓后不同時(shí)間點(diǎn)iNOS在骨骼肌中的表達(dá)情況以及血清中NO、SOD、MDA的含量變化，旨在驗(yàn)證缺血再灌注損傷發(fā)生時(shí)自由基參與骨骼肌損傷的過(guò)程，探討自由基參與壓瘡發(fā)生的機(jī)制。材料和方法一、壓瘡大鼠模型制備與動(dòng)物分組健康純系Wister大鼠(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)54只，雌雄不限，體重180一-2209。隨機(jī)分為1個(gè)對(duì)照組和8個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組6R。10％水合氯醛(300mg／kg)腹腔注射麻醉后，使大鼠仰臥固定于大鼠固定板上，用一重量為O．

7、56埏的鋼柱垂直施壓于大鼠左后肢，主要受壓的肌肉為股內(nèi)收肌和恥骨肌，鋼柱和肢體的接觸面積為直徑lcm的圓形表面，受壓部位單位面積承受的壓力為70kPa，施壓5h。對(duì)照組動(dòng)物麻醉后仰臥固定于大鼠固定板上5h。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組大鼠造模后解除固定，常規(guī)單只分籠飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物根據(jù)肢體受壓5h后放松的時(shí)間不同共分為8組，分別編號(hào)為再灌注組(IR組)：瓜0h組、IR4h組、IRl2h組、IR24h組、IR3d組、IRlw組、IR2w組、IR4w組。實(shí)驗(yàn)組大鼠分別在施壓5h后，再灌注Oh、4h、12h、24h

8、、3天、1周、2周、4周時(shí)，取左后肢施壓部位的股內(nèi)收肌置于4％多聚甲醛中固定后轉(zhuǎn)入30％蔗糖溶液中脫水，OCT常規(guī)包埋，冰凍切片機(jī)連續(xù)切片；另一部分新鮮受壓部位骨骼肌，液氮速凍后于．70"C保存，備用做Western-blot檢驗(yàn)骨骼肌中iNOS的表達(dá)。各組大鼠取腹主動(dòng)脈血液，離心后取血漿，．70℃冰箱保存?zhèn)溆茫?21型分光光度計(jì)，根據(jù)試劑盒操作規(guī)程檢測(cè)血清中SOD、NO、MDA的水平。對(duì)照組大鼠同法取材處理。2二、壓瘡大鼠骨骼肌組織的變化觀察1、對(duì)實(shí)驗(yàn)組大鼠骨骼肌進(jìn)行HE染色，以觀察肢體受壓