壓瘡大鼠骨骼肌組織inos的表達及血清中no、sod、mda變化的觀察

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1、中國醫(yī)科大學碩士學位論文壓瘡大鼠骨骼肌組織iNOS的表達及血清中NO、SOD、MDA變化的觀察姓名：臧爽申請學位級別：碩士專業(yè)：發(fā)育生物學指導教師：翟秀巖20090401·中文論著摘要·壓瘡大鼠骨骼肌組織iNOS的表達及血清中NO、SOD、MDA變化的觀察目的壓瘡(pressureulcer，PU)是臨床常見的并發(fā)癥之一，也是治療和護理的難題，一旦發(fā)生，不僅增加患者的痛苦，加重原發(fā)疾病，延長病程，嚴重可因繼發(fā)感染而危及生命。其形成是多因素參與的復(fù)雜過程，其中壓力是發(fā)生壓瘡最重要的危險因素，局部組

2、織受壓引起毛細血管血流不暢，血液回流受阻，進而導致組織的供氧和營養(yǎng)缺乏，當受壓組織恢復(fù)血液灌流后又發(fā)生缺血再灌注損傷(ischemiareperfusioninjury，IRI)。雖然目前對腦以及心肌等缺血再灌注損傷的研究較為深入，但迄今為止，壓瘡骨骼肌的缺血再灌注損傷的機制尚不十分明確，因此闡明壓瘡發(fā)生缺血再灌注損傷的機制，探討有針對性的防治措施，減輕或避免缺血再灌注損傷的發(fā)生，是防治壓瘡的關(guān)鍵。在壓瘡的缺血再灌注期，受壓組織大量釋放的自由基會加重組織損傷，因此對自由基的檢驗可以驗證缺血再灌注

3、損傷的發(fā)生以及嚴重程度。一氧化氮合酶(nitricoxidesynthase，NOS)是內(nèi)源性生物合成酶，依據(jù)NOS基因在染色體上的定位不同，分為3種亞型：神經(jīng)元型一氧化氮合酶(neuronalNOS，nNOS)、誘導型一氧化氮合酶(inducibleNOS，iNOS)、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(edothelialNOS，eNOS)。其中nNOS和eNOS又稱為結(jié)構(gòu)型NOS(constitutivenitricoxidesynthase，c：NOS)其表達依賴Ca+和鈣調(diào)蛋白(CAM)，是骨骼肌在生

4、理狀態(tài)下存在并表達的酶，由其產(chǎn)生的一氧化氮(nitricoxide，NO)主要發(fā)揮神經(jīng)遞質(zhì)和第二信使作用；iNOS是在損傷、缺血、炎癥介質(zhì)、內(nèi)毒素等病理因素的刺激下被激活，其活性不依賴Ca+和CaM，合成大量具有細胞毒性作用的NO，參與介導免疫反應(yīng)，可引起細胞和組織的損傷。組織缺血缺氧后，線粒體合成ATP減少，ATP依賴的離子泵衰竭，細胞內(nèi)鈣超載，黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)活化，花生四烯酸所引起的鏈式反應(yīng)激活，產(chǎn)生大量的自由基。NO也稱氮氧自由基，可以通過多條通路參與缺血再灌注損傷的發(fā)生；超氧化物岐化酶(

5、superoxidedismutase，SOD)是體內(nèi)重要的過氧化物酶，能及時清除可能產(chǎn)生的氧自由基，保護細胞免受氧化性損傷，其活性可反映機體清除氧自由基的能力；丙二醛(malondialdehyde，MDA)是氧自由基作用于生物膜多聚不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，其產(chǎn)生量與氧自由基的量相平衡，因而測定其含量可以反映組織中含有氧自由基的水平和組織內(nèi)脂質(zhì)過氧化的情況。研究資料表明缺血再灌注損傷參與壓瘡的形成，但壓瘡形成過程中自由基的產(chǎn)生機制及其在壓瘡形成過程中的作用尚不清楚。為此，本研究采

6、用外加物理壓力作用于大鼠肢體復(fù)制大鼠壓瘡模型，觀察肢體受壓后不同時間點iNOS在骨骼肌中的表達情況以及血清中NO、SOD、MDA的含量變化，旨在驗證缺血再灌注損傷發(fā)生時自由基參與骨骼肌損傷的過程，探討自由基參與壓瘡發(fā)生的機制。材料和方法一、壓瘡大鼠模型制備與動物分組健康純系Wister大鼠(中國醫(yī)科大學實驗動物中心提供)54只，雌雄不限，體重180一-2209。隨機分為1個對照組和8個實驗組，每組6R。10％水合氯醛(300mg／kg)腹腔注射麻醉后，使大鼠仰臥固定于大鼠固定板上，用一重量為O．

7、56埏的鋼柱垂直施壓于大鼠左后肢，主要受壓的肌肉為股內(nèi)收肌和恥骨肌，鋼柱和肢體的接觸面積為直徑lcm的圓形表面，受壓部位單位面積承受的壓力為70kPa，施壓5h。對照組動物麻醉后仰臥固定于大鼠固定板上5h。實驗組和對照組大鼠造模后解除固定，常規(guī)單只分籠飼養(yǎng)。實驗組動物根據(jù)肢體受壓5h后放松的時間不同共分為8組，分別編號為再灌注組(IR組)：瓜0h組、IR4h組、IRl2h組、IR24h組、IR3d組、IRlw組、IR2w組、IR4w組。實驗組大鼠分別在施壓5h后，再灌注Oh、4h、12h、24h

8、、3天、1周、2周、4周時，取左后肢施壓部位的股內(nèi)收肌置于4％多聚甲醛中固定后轉(zhuǎn)入30％蔗糖溶液中脫水，OCT常規(guī)包埋，冰凍切片機連續(xù)切片；另一部分新鮮受壓部位骨骼肌，液氮速凍后于．70"C保存，備用做Western-blot檢驗骨骼肌中iNOS的表達。各組大鼠取腹主動脈血液，離心后取血漿，．70℃冰箱保存?zhèn)溆茫?21型分光光度計，根據(jù)試劑盒操作規(guī)程檢測血清中SOD、NO、MDA的水平。對照組大鼠同法取材處理。2二、壓瘡大鼠骨骼肌組織的變化觀察1、對實驗組大鼠骨骼肌進行HE染色，以觀察肢體受壓