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《egfp的原核表達(dá)分析》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫(kù)。
1、EGFP的原核表達(dá)分析首都師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院100048摘要：利用PCR反應(yīng)擴(kuò)增出所需要的EGFP基因，與pTrcHis蛋白表達(dá)載體重組，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21,提取質(zhì)粒，誘導(dǎo)EGFP蛋白表達(dá)，進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化并用SDS-PAGE和Western-blot做檢測(cè)。這個(gè)實(shí)驗(yàn)讓我們充分熟悉了整個(gè)流程。關(guān)鍵詞：綠色熒光蛋白蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、分離純化表達(dá)蛋白檢測(cè)E.coli材料和方法：1、主要材料及儀器1.1、菌株和質(zhì)粒：大腸桿菌BL21為本實(shí)驗(yàn)室保存；重組篩選質(zhì)粒pTrcHis購(gòu)自Invitroge公司
2、。1.2、培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基（液/固）內(nèi)含氨芐青霉素濃度為100ug/ml。1.3、器材和試劑器材：移液槍、PCR儀、離心機(jī)—（HetticZENTRIFUGEND-78532Tuttlingen）、SIGMA2-16K(4℃離心機(jī))、SIGMA3-18K(離50ml大離心管)、紫外透射觀察儀、水浴鍋、核酸電泳儀（BIO-RAD）、超聲波破碎儀（SONICSVIbracell）、氣浴恒溫振蕩器（THZ-82江蘇金壇市金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠）、SDS-PAGE電泳裝置、WesternBlotting電轉(zhuǎn)移
3、裝置、水平搖床（WD-9405）、膠片觀察燈（WD-9406）、封口機(jī)、超凈臺(tái)、250ml錐形瓶。試劑：PCR反應(yīng)體系緩沖液（10~50mMTris-HCl，50mMKCl，1.5mMMgCl2）、DNA聚合酶（TaqE）、dNTPs混合物（每種2.5mM）、博大泰克PCR產(chǎn)物快速回收試劑盒、限制性核酸內(nèi)切酶（BglII、EcoRI）、0.5MEDTA、瓊脂糖凝膠（1g瓊脂糖、100ml1xTAE、10ulEB）、電泳緩沖液（50xTAE、Tris—乙酸、EDTA）、溴酚蘭、蔗糖、甘油、連接酶（購(gòu)于
4、Promega公司的T4DNA連接酶及10×ligationbuffer）、0.1MCaCl2、堿裂解液（溶液I：50mM葡萄糖、25mMTris-HCl，pH=8.0、10mMEDTA；溶液II：0.2MNaOH，1％SDS；溶液III：5MKAc，11.5ml冰醋酸，加水定容至100ml）、RNaseA、無(wú)水乙醇、PBS緩沖液、裂解緩沖液（含20mM咪唑）、沖洗液（含100mM咪唑）、洗脫液（含500mM咪唑）、5×樣品緩沖液、30%凝膠貯液、4×分離膠緩沖液、4×濃縮膠緩沖液（4℃保存）、TE
5、MED原液、10%過(guò)硫酸銨、Tris-甘氨酸電極緩沖液（pH=8.3）、考馬斯亮藍(lán)G250染色液、GFP抗體（200ug/ml，用pH=7.5TBS配置)、轉(zhuǎn)移緩沖液、TBS、封閉液（5%脫脂奶粉）、顯色液（氯萘酚，30mg/ml于甲醇中）、ddH2O、脫色液（（100ml冰乙酸:100ml乙醇:800ml蒸餾水）2、方法2．1、EGFP基因的PCR擴(kuò)增及其電泳檢測(cè)在一滅菌的0.2mL小離心管中依次加入(總體積為50ml)：10×buffer(Mg2+)5ml4×dNTPs（每種2.5mM）8mlE
6、GFP-F1mlEGFP-R1mlTemplate(模板)34mlTaqE1ml--------------------------------------------------------------------------------Totalvolume50μl循環(huán)參數(shù)94℃3min94℃30s55℃30s27cycle72℃1min72℃10min4℃保存2.2、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的回收———試劑盒法1)、柱平衡：向吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中）加入500ml的平衡液BL，12000rp
7、m離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CB2重新放回收集管中。2)、上樣：估計(jì)PCR反應(yīng)液，向其中加入5倍體積的結(jié)合液PB，充分混勻,然后移入吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中），室溫放置2分鐘，12000rpm離心30~60秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CB2放入收集管中。3)、漂洗：向吸附柱CB2中加入600ml漂洗液PW（使用前先檢查是否已加入無(wú)水乙醇），靜止2min后，12,000rpm離心30-60秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CB2放入收集管中。4)、漂洗：重復(fù)步驟3。5)、甩干
8、：將吸附柱CB2放回收集管中，12000rpm，離心2分鐘，盡量除去漂洗液。將吸附柱CB2開蓋置于室溫放置數(shù)分鐘，徹底地晾干，以防止殘留的漂洗液影響下一步的實(shí)驗(yàn)。6)、洗脫：將吸附柱CB2放入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加30~50ml洗脫緩沖液EB，室溫放置2分鐘。12000rpm離心2分鐘收集DNA溶液。2.3、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物6ml6x樣品緩沖液1ml混勻后加入樣品孔中，100V電泳20-30min2.4、酶切產(chǎn)物的回收———試劑
