蛋白與核酸作用檢測(cè)1-Luciferase報(bào)告基因系統(tǒng)

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1、編號(hào)：3-1主題：Luciferase報(bào)告基因系統(tǒng)概述：Luciferase報(bào)告基因系統(tǒng)是以熒光素(luciferin)為底物來(lái)檢測(cè)螢火蟲(chóng)熒光素酶(fireflyluciferase)活性的一種報(bào)告系統(tǒng)。熒光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的過(guò)程中，會(huì)發(fā)出生物熒光(bioluminescence)。然后可以通過(guò)熒光測(cè)定儀也稱化學(xué)發(fā)光儀(luminometer)或液閃測(cè)定儀測(cè)定luciferin氧化過(guò)程中釋放的生物熒光。熒光素和熒光素酶這一生物發(fā)光體系，可以極其靈敏、高效地檢測(cè)基因的表達(dá)。是檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子與目的基因啟動(dòng)子區(qū)D

2、NA相互作用的一種檢測(cè)方法。原理簡(jiǎn)述如下:(1)構(gòu)建一個(gè)將靶啟動(dòng)子的特定片段插入到熒光素酶表達(dá)序列前方的報(bào)告基因質(zhì)粒，如pGL3-basic等。(2)將要檢測(cè)的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)質(zhì)粒與報(bào)告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞或其它相關(guān)的細(xì)胞系。如果此轉(zhuǎn)錄因子能夠激活靶啟動(dòng)子，則熒光素酶基因就會(huì)表達(dá)，熒光素酶的表達(dá)量與轉(zhuǎn)錄因子的作用強(qiáng)度成正比。(3)加入特定的熒光素酶底物，熒光素酶與底物反應(yīng)，產(chǎn)生熒光，通過(guò)檢測(cè)熒光的強(qiáng)度可以測(cè)定熒光素酶的活性，從而判斷轉(zhuǎn)錄因子是否能與此靶啟動(dòng)子片段有作用。目的：檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子與目的基因啟動(dòng)子區(qū)DNA相互作用步驟：使用Promega公司的Dual-lucifera

3、seReporterAssaySystem進(jìn)行檢測(cè):1)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的目的細(xì)胞，接種于24孔培養(yǎng)板中，繼續(xù)培養(yǎng)16~24h,待細(xì)胞匯片至70~80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染；2)將Luciferase報(bào)告基因質(zhì)粒、Renilla對(duì)照質(zhì)粒及其它質(zhì)粒（根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)確定）共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。每組設(shè)3個(gè)平行孔，37°C，5%CO2條件下培養(yǎng)24h；3)棄去培養(yǎng)基，用冰預(yù)冷的PBS洗2次，以除去殘余培養(yǎng)基。每孔細(xì)胞加入100μl1XPassiveLysisBuffer，輕微振蕩，室溫15min；4)打幵ModulusTM微孔板型多功能光度計(jì)，預(yù)熱后，設(shè)置相應(yīng)參數(shù)。自動(dòng)注射器進(jìn)樣體積25μl；注射后在讀數(shù)前

4、的延遲時(shí)間:2s；檢測(cè)的積分時(shí)間:10s；5)取20μl裂解產(chǎn)物加入到96孔發(fā)光檢測(cè)板中，放入發(fā)光測(cè)試儀讀值。6)拷貝檢測(cè)結(jié)果,進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；7)相對(duì)轉(zhuǎn)錄效率的計(jì)算。流程圖：