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1、第六章報告基因檢測系統(tǒng)公司現(xiàn)已發(fā)展的有三種報告基因檢測系統(tǒng):NF-Kb,p53,NFAT.根據(jù)待檢基因對其作用的原理,及在藥物,抗體等作用下,產生的不同效果,這三種報告基因系統(tǒng)又具體可以分為:NF-kB刺激系統(tǒng)和NF-kB抑制系統(tǒng);p53刺激系統(tǒng)和p53抑制系統(tǒng);NFAT刺激系統(tǒng)和NFAT抑制系統(tǒng).1.NF-kB報告基因檢測系統(tǒng)(NF-kB刺激系統(tǒng);NF-kB抑制系統(tǒng))1.1細胞培養(yǎng)1)細胞株及材料細胞株:293-T細胞培養(yǎng)基:DMEM(10%FBSGBICO),DMEM(無血清)培養(yǎng)器皿:T75(75cm2)培養(yǎng)瓶(以下相同),24孔細胞培養(yǎng)
2、板2)細胞培養(yǎng)及鋪板a)傳代:用DMEM(10%FBS)培養(yǎng)基接種293T至75cm2培養(yǎng)瓶,細胞長滿后鋪板并傳代.注:一般一瓶細胞總數(shù)可以達到3×107個,可以按1:8分瓶.b)鋪板:細胞消化:將培養(yǎng)好的293T細胞,傾去培養(yǎng)基,加入1-2ml1×胰酶輕輕搖晃以覆蓋整瓶細胞,37℃培養(yǎng)箱放置2-3min,觀察細胞從瓶壁上脫落下來(也可以用手拍擊瓶壁),顯微鏡下觀測到細胞成單個,或是只有2-3個細胞聚團,即可以加入含有血清的DMEM(10%FBS)10ml左右,終止胰酶的消化作用,隨后從中取少量細胞計數(shù).細胞計數(shù):如果細胞密度較大,可按一定倍數(shù)
3、稀釋后計數(shù),細胞密度的計算按照公式:細胞密度(單位:個/ml)=(4個大方格的細胞總數(shù)/4)×104×稀釋倍數(shù)鋪板:24孔板按照每孔1.0105(NF-kB刺激系統(tǒng))或0.8105(NF-kB抑制系統(tǒng)),接種體積為500L來鋪板.細胞加入后將24孔板沿水平面桌面的方向前后左右來回晃動(勿轉動),使細胞能夠均勻分布,放置細胞培養(yǎng)箱生長.1.2轉染1)試劑及材料:轉染試劑:Lipofectamin2000質粒:a:對照質粒:pEF-BOSTRAF6(NF-kB刺激系統(tǒng))DominantnegativeTRAF6(NF-kB抑制系統(tǒng))b:NF-kB-
4、lucreportplasmidc:目的基因質粒,構建在pEF-FN載體上2)轉染:鋪板后24小時轉染,每個樣品須作3個重復孔,目的是為消除實驗誤差,并且在24孔板上相應位置做好標記.在A,B兩個eppendorf管中分別加入:A:0.1gNFkB-lucreportergene+0.4ginterestgene+serumfreeDMEM至終體積50l/孔.B:1.5Llipofectamine2000+48.5LserumfreeDMEM體積為50l/孔,室溫放置5minA,B二者混合,室溫放置20-30min后將混合液緩慢而均勻的加到24
5、孔板細胞液中,每孔為100L,輕輕搖晃,使DNA分布均勻,培養(yǎng)24hr.NF-kB刺激系統(tǒng):negativecotrol:pEF-BOSpositivecontrol:TRAF6,NF-kB抑制系統(tǒng):negativecotrol:pEF-BOSpositivecontrol:DominantnegativeTRAF6(TRAF6DN).(進一步具體轉染方法可以參照Lipofectamin2000的說明書.)1.3細胞收獲及處理刺激因子:TNF(腫瘤壞死因子),母液濃度2g/Ml,使用濃度20ng/mlBuffer:5×PBL裂解液(Tricin
6、e:pH7.8,40mM;NaCL:50mM;EDTA:2mM;MaSO4:1mM;DTT:5mM;TritonX-100:1%)1)NF-kB刺激系統(tǒng):轉染后24小時先通過熒光顯微鏡觀察GFP表達的強弱以判斷轉染效率,處理細胞.2)NF-kB抑制系統(tǒng):轉染后24小時先通過熒光顯微鏡觀察GFP表達的強弱以判斷轉染效率加藥刺激:TNF用DMEM培養(yǎng)基稀釋后,200l/孔換液.加藥刺激12-16小時后收細胞.3)細胞處理:吸干培養(yǎng)液,24孔板中每孔加入1×PBLbuffer,在搖床上振蕩10-15分鐘.置于冰上后,取出5l裂解液,加入發(fā)光管中,可以
7、馬上上機檢測,可以馬上上機,或放入-80C保存.1.4luciferase分析參見promega公司的TECHNICALMANUAL上機操作方法附在后面.1.5Western-blot檢測待檢基因的表達情況見后.2.p53報告基因檢測系統(tǒng)(P53抑制系統(tǒng))p53刺激系統(tǒng)仍在優(yōu)化之中,因此主要介紹p53抑制系統(tǒng)的操作步驟.2.1細胞培養(yǎng)及鋪板1)細胞株及材料:細胞株:Saos(p53-/-),細胞骨肉瘤細胞(Osteosarcomacell),缺失p53基因.培養(yǎng)基:DMEM(10%FBSGBICO),DMEM(無血清)培養(yǎng)器皿:75cm2培養(yǎng)瓶
8、,24孔細胞培養(yǎng)板2)細胞培養(yǎng)及鋪板:a)傳代:用DMEM(10%FBS)培養(yǎng)基接種Saos至75cm2培養(yǎng)瓶,細胞長滿后鋪板并傳代.一瓶75cm2的
