報告基因檢測.doc

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1、熒光素酶報告基因原理：轉(zhuǎn)錄因子是一種具有特殊結(jié)構(gòu)、行使調(diào)控基因表達(dá)功能的蛋白質(zhì)分子，也稱為反式作用因子。某些轉(zhuǎn)錄因子僅與其靶啟動子中的特異序列結(jié)合，這些特異性的序列被稱為順式作用元件，轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合域和順式作用元件實(shí)現(xiàn)共價結(jié)合，從而對基因的表達(dá)起抑制或增強(qiáng)的作用。熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)（luciferaseassay）是檢測這類轉(zhuǎn)錄因子和其靶啟動子中的特異順序結(jié)合的重要手段。其原理簡述如下：（1）構(gòu)建一個將靶啟動子的特定片段插入到熒光素酶表達(dá)序列前方的報告基因質(zhì)粒，如pGL3-basic等。（2

2、）將要檢測的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)質(zhì)粒與報告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞或其它相關(guān)的細(xì)胞系。如果此轉(zhuǎn)錄因子能夠激活靶啟動子，則熒光素酶基因就會表達(dá)，熒光素酶的表達(dá)量與轉(zhuǎn)錄因子的作用強(qiáng)度成正比。（3）加入特定的熒光素酶底物，熒光素酶與底物反應(yīng)，產(chǎn)生熒光，通過檢測熒光的強(qiáng)度可以測定熒光素酶的活性，從而判斷轉(zhuǎn)錄因子是否能與此靶啟動子片段有作用。步驟：1、(1)鋪細(xì)胞于24孔板中，{選用48孔板（如果比較難做的系統(tǒng)可以選用24孔板甚至12孔板，細(xì)胞量越多表達(dá)的酶相應(yīng)越多），鋪板密度約為30%（如果比較著急做實(shí)驗(yàn)，密度可以

3、提高）。}每孔細(xì)胞數(shù)為20萬細(xì)胞左右，待細(xì)胞融匯度達(dá)到70%（適合磷酸鈣轉(zhuǎn)染）、85%（適合脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染）時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。一般選用細(xì)胞密度為50-70%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染（因?yàn)檗D(zhuǎn)染后要讓質(zhì)粒表達(dá)一定的時間，一般是18-24小時，故而這個細(xì)胞密度到加藥時密度會差不多到100%）。轉(zhuǎn)染體系的配置：目標(biāo)蛋白的質(zhì)粒（pBind-），luc質(zhì)粒，fermentas轉(zhuǎn)染試劑，（質(zhì)粒：轉(zhuǎn)染試劑=1：1-3（μg：μL）這個比例根據(jù)細(xì)胞、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染難易程度而定，必要時需要自己摸條件）?！瞬襟E與與普通的細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的要求相同。脂

4、質(zhì)體法（1）在細(xì)胞密度達(dá)到80%左右，于轉(zhuǎn)染前1小時用基本培養(yǎng)基（常用無血清培養(yǎng)基Opti-MEM）為細(xì)胞換液?！緦D(zhuǎn)染后易死的細(xì)胞可用不含雙抗但含有10%FBS的DMEM或1640培養(yǎng)基】（2）根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)皿的大小，按下表配制轉(zhuǎn)染試劑體系。將適量欲轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒DNA與適量體積的Opti-MEM混勻。同時，將適量的脂質(zhì)體【采用下表中所給量的一半】也和適量的Opti-MEM混合。室溫靜置5分鐘【時間過長會降低脂質(zhì)體活性】。（3）將（2）中兩溶液轉(zhuǎn)移到同一EP管中，吹打使其混勻。靜置20分鐘。（4）將質(zhì)粒

5、DNA和脂質(zhì)體混合液加入到細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)（5%CO2，37℃）4－6小時后更換正常培養(yǎng)基（含雙抗和10%FBS）。脂質(zhì)體法各試劑用量DNA(ug)opti培養(yǎng)基（μl）脂質(zhì)體（μl）opti培養(yǎng)基（μl）96well0.2200.52024well0.8502.05012well1.61004.01003.5cm4.025010.02506cm8.050020.050010cm24150060.015002在轉(zhuǎn)染合適的時間點(diǎn)，換成含血清（10%FBS）基本培養(yǎng)基培養(yǎng)24小

6、時左右，再根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要處理細(xì)胞。3加Reporterlysisbuffer裂解細(xì)胞之前棄去培養(yǎng)液，500μl預(yù)冷的PBS清洗細(xì)胞兩次，吸盡PBS?！獰晒饷傅拿复俜磻?yīng)會被痕量的鈣所抑制，故用磷酸鈣轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在收集細(xì)胞前應(yīng)充分洗滌除去含鈣介質(zhì)。4每孔中加入120μl1×Reporterlysisbuffer。室溫放置2-5分鐘裂解細(xì)胞，將24孔板放在-80℃冰箱，待測定時，室溫放置，將其融化?！?80℃到室溫的單次凍融有助于細(xì)胞裂解。5利用Luciferaseassaykit試劑盒測定熒光素酶的活性

7、：取20μl細(xì)胞裂解上清液，加入熒光素酶底物50μl，迅速混勻，測定熒光素酶的活性。—一個樣品做三個平行實(shí)驗(yàn)，在上清液與熒光素酶底物迅速、充分混勻的同時保證每份樣品加入酶標(biāo)板的時間間隔一致。裂解—加熒光素酶試劑1）5XlysisinddH2o，稀釋到1X。60ulX51(48孔板)=3060ulddH2o2448ullysis5X612ul每孔60ul裂解細(xì)胞，于-80°C10min,4°C10min,反復(fù)凍融易于裂解。2）fireflyluciferasesubstrate50ulX51=2550

8、ulluciferase1X2290ulLuci(棕色管)10X255ulATP500X5ul每個孔加50ulluciferase于雙報告基因儀器檢測。3）Renillasubstrate50ulX50=stopbuffer(CTZbuffer)1X2225ulstop（透明管）10X250ulslip(棕色管)100X25ul再加50ulrelina于雙報告基因儀器檢測6β-半乳糖苷酶活性的測定：取10μl細(xì)胞裂解液，加入120μl下面混合的試劑：3μl100×Mg