資源描述：
《沙門菌多重pcr檢測方法的建立及雞白痢沙門菌aroa缺失株的構(gòu)建》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、學(xué)位論文沙門菌多重PCR檢測方法的建立及雞白痢沙門菌aroA缺失株的構(gòu)建DevelopmentofaMutiplexPCRforDetectionofSalmonellaandConstructionofSalmonellaPuilorumaroAMutants公益行業(yè)專項(201303044)研究生：楊林專業(yè)：預(yù)防獸醫(yī)學(xué)導(dǎo)師：彭大新教授陳素娟副教授揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院2014年6月楊林：沙門菌多重PCR檢測方法的建立及雞白痢沙門菌aroA缺失株的構(gòu)建三沙門菌多重PCR檢測方法的建立及雞白痢沙門菌aroA繁黧鼉／／lⅧl[I／I／Hl[[1l
2、lllllll／]1301lll／／／llll[／lllll／6[1[1l／2633ti碩士研究生：楊林丫1眾摘要沙門菌是一種兼性胞內(nèi)致病菌，能夠引起系統(tǒng)或局部感染。宿主感染后既可引起胃腸炎、流產(chǎn)、敗血癥等癥狀，又可表現(xiàn)為帶菌不發(fā)病的狀態(tài)。隨著抗菌藥物在臨床和動物飼料中的廣泛使用，沙門菌耐藥性日趨嚴重，在多種動物中的感染率亦逐漸上升，引起了巨大的經(jīng)濟損失。沙門菌的鑒定主要是通過細菌分離、血清型鑒定、生化鑒定等傳統(tǒng)方法，但是傳統(tǒng)方法費時費力，有些血清型難以區(qū)分。因此，迫切需要一種能夠快速檢測沙門菌的方法，并且采取有效的防制措施來降低家禽的感
3、染率，提高家禽及其產(chǎn)品的質(zhì)量。本研究根據(jù)沙門菌屬特異性基因(hut)及腸炎沙門菌(SdfI)，鼠傷寒沙門菌(Spy)，雞白痢沙門菌(glgC)，雞傷寒沙門菌(gtgC和speC)的血清型特異性基因分別設(shè)計一對引物，建立了mPCR方法，可同時檢測鑒定出腸炎沙門菌、鼠傷寒沙門菌、雞白痢沙門菌及雞傷寒沙門菌。選取由mPCR方法鑒定出的雞白痢沙門菌S004、S005、S017及實驗室保存菌$6702株，利用LRed同源重組技術(shù)，成功構(gòu)建了雞白痢沙門菌aroA缺失株：S004AaroA、S005AaroA、S017ziaroA和S6702AaroA
4、，并對其生物學(xué)特性及毒力進行了測定，為沙門菌減毒活疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。1快速檢測腸炎、鼠傷寒、雞白痢及雞傷寒沙門菌mPCR方法的建立根據(jù)沙門菌屬特異性基因(hut、495bp)及腸炎沙門菌(SdfI、304bp)、鼠傷寒沙門菌(Spy、401bp)、雞白痢沙門菌(glgC、252bp)和雞傷寒沙門菌(glgC、252bp和speC、174bp)的血清型特異性基因分別設(shè)計引物，調(diào)節(jié)模板用量，dNTP、Taq酶的比例和退火溫度，建立mPCR方法。菌液PCR敏感度結(jié)果顯示：腸炎沙門菌、鼠傷寒沙門菌、雞白痢沙門菌和雞傷寒沙門菌的最低檢出量均為3
5、×103CFU；提取沙門菌DNA的敏感度結(jié)果顯示：鑒別腸炎、鼠傷寒、雞白痢和雞傷寒沙門菌的最低檢量分別為162pg／pL、202pg／laL、214pg／I．tL和178pg／l上L。與常規(guī)的分離鑒定相比，所建立的mPCR檢測沙門菌屬和鼠傷寒揚州大學(xué)碩士學(xué)位論文沙門菌的敏感性、特異性、符合率均為100％；檢測腸炎沙門菌的敏感性、特異性、符合率分別為100％、98％、98．2％；檢測雞白痢沙門菌的敏感性、特異性、符合率分別為100％、94．6％、96．4％。不在其中的血清型也可以通過屬特異性基因hut基因的擴增檢測出，因此不會漏檢臨床樣品中
6、的沙門菌。2雞白痢沙門菌aroA基因缺失株的構(gòu)建及其生物學(xué)特性的初步研究根據(jù)GenBank提供的基因序列擴增雞白痢沙門菌臨床分離菌株的aroA基因。利用九Red同源重組技術(shù)，構(gòu)建雞白痢沙門菌aroA缺失株：S0043aroA、S005AaroA、S017AaroA和S67023aroA。通過PCR鑒定，缺失株構(gòu)建成功。4株野生株及其缺失株的生長曲線顯示，野生株中$6702生長速度最快，其它3株雞白痢沙門菌生長速度相似：與野生株相比，缺失株的生長速度均有所下降，缺失株中S6702AaroA生長速度最快。用不同劑量的野生株與缺失株分別通過肌肉
7、接種2日齡SPF雛雞，測定其半數(shù)致死量(LD50)，結(jié)果顯示，野生株S004、S005、S017和$6702的LD50分別為106·30、107040、106612和10834，而缺失株S004zlaroA、S005AaroA、S0173aroA和S6702AaroA的LD50分別為108卸、108256、108190和108‘57。可以看出，S004缺失株毒力顯著降低，$6702缺失株毒力降低最少，但是其野生株毒力較其他野生株毒力也較弱。因此，aroA的缺失對雞白痢沙門菌的致弱作用與菌株有關(guān)。雞白痢沙門菌aroA致弱株的構(gòu)建為疫苗候選株
8、的篩選奠定了基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：雞白痢沙門菌，多重PCR，aroA基因，九RED同源重組，缺失株楊林：沙門菌多重PCR檢測方法的建立及雞白痢沙門菌aroA缺失株的構(gòu)建DevelopmentofaMu
