葡萄糖測定-葡萄糖氧化酶法

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1、葡萄糖氧化酶法測定血清（漿）葡萄糖【原理】葡萄糖氧化酶(glucoseoxidase，GOD)利用氧和水將葡萄糖氧化為葡萄糖酸，并釋放過氧化氫。過氧化物酶(peroxidase，POD)在色原性氧受體存在時將過氧化氫分解為水和氧，并使色原性氧受體4-氨基安替比林和酚去氫縮合為紅色醌類化合物，即Trinder反應(yīng)。紅色醌類化合物的生成量與葡萄糖含量成正比。【試劑】1．0.1mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.0)稱取無水磷酸氫二鈉8.67g及無水磷酸二氫鉀5.3g溶于蒸餾水800ml中，用1mol/L氫氧化鈉(或1mol/L鹽酸)調(diào)pH至

2、7.0，用蒸餾水定容至1L。2．酶試劑稱取過氧化物酶1200U，葡萄糖氧化酶1200U，4-氨基安替比林10mg，疊氮鈉100mg，溶于磷酸鹽緩沖液80ml中，用1mol/LNaOH調(diào)pH至7.0，用磷酸鹽緩沖液定容至100ml，置4℃保存，可穩(wěn)定3個月。3．酚溶液稱取重蒸餾酚100mg溶于蒸餾水100ml中，用棕色瓶貯存。4．酶酚混合試劑酶試劑及酚溶液等量混合，4℃可以存放1個月。5．12mmol/L苯甲酸溶液溶解苯甲酸1.4g于蒸餾水約800ml中，加溫助溶，冷卻后加蒸餾水定容至lL。6．100mmol/L葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)貯存液稱取已

3、干燥恒重的無水葡萄糖1.802g，溶于12mmol/L苯甲酸溶液約70ml中，以12mmol/L苯甲酸溶液定容至100ml。2h以后方可使用。7．5mmol/L葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)貯存液5.0ml放于100ml容量瓶中，用12mmol/L苯甲酸溶液稀釋至刻度，混勻?！静僮鞑襟E】1．自動分析法按儀器說明書的要求進(jìn)行測定。2．手工操作法取試管3支，按下表操作。葡萄糖氧化酶法測血糖操作步驟加入物(ml)空白管標(biāo)準(zhǔn)管測定管血清－－0.02葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液－0.02－蒸餾水0.02－－酶酚混合試劑3.03.03.0混勻，置37℃水浴

4、中，保溫15min，在波長505nm處比色，以空白管調(diào)零，讀取標(biāo)準(zhǔn)管及測定管吸光度?！居嬎恪俊緟⒖挤秶?空腹血清葡萄糖為3.89～6.11mmol/L?！九R床意義】1．生理性高血糖可見攝入高糖食物后，或情緒緊張腎上腺分泌增加時。2．病理性高血糖(1)糖尿病：病理性高血糖常見于胰島素絕對或相對不足的糖尿病患者。(2)內(nèi)分泌腺功能障礙：甲狀腺功能亢進(jìn)，腎上腺皮質(zhì)功能及髓質(zhì)功能亢進(jìn)。引起的各種對抗胰島素的激素分泌過多也會出現(xiàn)高血糖。注意升高血糖的激素增多引起的高血糖，現(xiàn)已歸入特異性糖尿病中。(3)顱內(nèi)壓增高：顱內(nèi)壓增高刺激血糖中樞，如顱

5、外傷、顱內(nèi)出血、腦膜炎等。(4)脫水引起的高血糖：如嘔吐、腹瀉和高熱等也可使血糖輕度增高。3．生理性低血糖見于饑餓和劇烈運(yùn)動。4．病理性低血糖(特發(fā)性功能性低血糖最多見，依次是藥源性、肝源性、胰島素瘤等)(1)胰島β細(xì)胞增生或胰島β細(xì)胞瘤等，使胰島素分泌過多。(2)對抗胰島素的激素分泌不足，如垂體前葉功能減退、腎上腺皮質(zhì)功能減退和甲狀腺功能減退而使生長素、腎上腺皮質(zhì)激素分泌減少。(3)嚴(yán)重肝病患者，由于肝臟儲存糖原及糖異生等功能低下，肝臟不能有效地調(diào)節(jié)血糖?！咀⒁馐马?xiàng)】1．葡萄糖氧化酶對β-D葡萄糖高度特異，溶液中的葡萄糖約36%為

6、α型，64%為β型。葡萄糖的完全氧化需要α型到β型的變旋反應(yīng)。國外某些商品葡萄糖氧化酶試劑盒含有葡萄糖變旋酶，可加速這一反應(yīng)，但在終點(diǎn)法中，延長孵育時間可達(dá)到完成自發(fā)變旋過程。新配制的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液主要是α型，故須放置2h以上(最好過夜)，待變旋平衡后方可應(yīng)用。2．葡萄糖氧化酶法可直接測定腦脊液葡萄糖含量，但不能直接測定尿液葡萄糖含量。因?yàn)槟蛞褐心蛩岬雀蓴_物質(zhì)濃度過高，可干擾過氧化物酶反應(yīng)，造成結(jié)果假性偏低。3．測定標(biāo)本以草酸鉀－氟化鈉為抗凝劑的血漿較好。取草酸鉀6g，氟化鈉4g。加水溶解至100ml。吸取0.1ml到試管內(nèi)，在80℃

7、以下烤干使用，可使2～3ml血液在3～4天內(nèi)不凝固并抑制糖分解。4．本法用血量甚微，操作中應(yīng)直接加標(biāo)本至試劑中，再吸試劑反復(fù)沖洗吸管，以保證結(jié)果可靠。5．嚴(yán)重黃疸、溶血及乳糜樣血清應(yīng)先制備無蛋白血濾液，然后再進(jìn)行測定?！驹u價】?線性范圍至少可達(dá)22.24mmol/L，回收率94%～105%，批內(nèi)CV為0.7%～2.0%。批間CV為2%左右，日間CV為2%～3%。葡萄糖氧化酶法與己糖激酶法比較，73份標(biāo)本葡萄糖氧化酶法均值為8.31mmol/L，已糖激酶法均值8.21mmol/L，相關(guān)系數(shù)為0.9986，回歸方程y=1.0026x－2

8、.29。本法測定葡萄糖非常特異，從原理反應(yīng)式中可知第一步是特異反應(yīng)，第二步特異性較差。誤差往往發(fā)生在反應(yīng)的第二步。一些還原性物質(zhì)如尿酸、維生素C、膽紅素和谷胱甘肽等，可與色原性物質(zhì)競爭過氧化氫，從而消耗反應(yīng)過程中所產(chǎn)生的過氧化氫，產(chǎn)生