銀杏內(nèi)酯b對大鼠體外bmscs向神經(jīng)樣細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用研究

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1、徐州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文銀杏內(nèi)酯B對大鼠體外BMSCs向神經(jīng)樣細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用研究姓名：劉德全申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：神經(jīng)病學(xué)指導(dǎo)教師：劉永海2012-03徐州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文———————————————————————————————————————————————————一——-銀杏內(nèi)酯B對大鼠體外BMSCs向神經(jīng)樣細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用研究中文摘要目的通過檢測銀杏內(nèi)酯B誘導(dǎo)后神經(jīng)樣細(xì)胞的功能及分化程度，研究銀．爵內(nèi)酯B對SD大鼠BMSCs向神經(jīng)樣細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用，從而為藥物誘導(dǎo)后干細(xì)胞的體內(nèi)移植提供實(shí)驗(yàn)支

2、持。方法將四周齡SD大鼠(雌雄不限)，無菌條件下分離股骨和脛骨，利用密度梯度離心法和貼壁培養(yǎng)法分離純化BMSCs。取第三代BMSCs，流式細(xì)胞儀儉測后，選取分布均一的細(xì)胞，隨即分為3組，PBS組、FGF組、GB組，又依據(jù)不同濃度GB組分為四個(gè)亞組GBI(20n1∥L)；GB2(40mg／L)：GB3(60rag／L)；GB4(80mg／L)，分別對BMSCs進(jìn)行誘導(dǎo)分化：倒置顯微鏡下于24h、48h、72h后觀察各組細(xì)胞形態(tài)，應(yīng)用膜片鉗技術(shù)，采用全細(xì)胞記錄方式，檢測GB處理組和PBS組細(xì)胞的電生理；采用免疫熒光方

3、法分別檢測乙酰膽堿合成酶、膠質(zhì)原纖維酸性蛋白、神經(jīng)元特異性烯醇化酶染色陽性細(xì)胞的表達(dá)情況。結(jié)果BMSCs鑒定：1、形態(tài)學(xué)觀察：對獲耿細(xì)胞經(jīng)過梯度密度離心法結(jié)合連續(xù)換液培養(yǎng)傳至第三代，細(xì)胞逐漸純化，形態(tài)均一，貼壁好，形態(tài)學(xué)觀察到細(xì)胞扁平呈梭型，集落細(xì)胞排列有一定方向性，呈輻射狀、旋渦狀排列。2、流式細(xì)胞學(xué)鑒定：對第三代細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示CD90、CD29、陽性細(xì)胞數(shù)在90％左右，CD34、CD45陽性細(xì)胞小于1％。3、分化能力：經(jīng)GB、FGF誘導(dǎo)的BMSCs細(xì)胞在形態(tài)學(xué)和免疫熒光、神經(jīng)電生理檢測證實(shí)其有向神經(jīng)

4、樣細(xì)胞的轉(zhuǎn)化能力。誘導(dǎo)后細(xì)胞的鑒定：l、形態(tài)學(xué)觀察：倒置顯微鏡下觀察經(jīng)GB誘導(dǎo)24h后少量細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞突起逐漸增多，突起相互連接形成’徐州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文網(wǎng)狀，胞體收縮變圓，并出現(xiàn)突起，立體感、折旋光性增強(qiáng)，并可見細(xì)胞問形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，48h誘導(dǎo)的細(xì)胞形態(tài)更加明顯，細(xì)胞突起變長，折光性強(qiáng)，72小時(shí)誘導(dǎo)后的細(xì)胞可見胞核橢圓形或圓形，胞核周邊可見明顯光暈。誘導(dǎo)24h、48h、72h后的每百個(gè)細(xì)胞中神經(jīng)樣細(xì)胞數(shù)量統(tǒng)計(jì)顯示，不同劑量銀杏內(nèi)酯B組較PBS組明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P(0．01

5、)，與PBS組比較，誘導(dǎo)組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0．05)，銀杏內(nèi)酯B組各劑量組問比較無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>O．05)。2、經(jīng)GB誘導(dǎo)后的的神經(jīng)樣細(xì)胞與未誘導(dǎo)的BMSCs的膜電位特性有顯著的改變，得到的神經(jīng)樣細(xì)胞具有類似于神經(jīng)元的電生理的改變。GB誘導(dǎo)后細(xì)胞與對照組誘導(dǎo)細(xì)胞的電流幅值存在較大差異。全細(xì)胞電壓鉗記錄模式下，可記錄到一系列內(nèi)向電流，激活閾值在．30mV，峰值電壓在0mV，未分化細(xì)胞的峰值電流為(1．474-0．15PA／PF，n=10)，GB誘導(dǎo)后的神經(jīng)樣細(xì)胞為(2．184-0．16PA／PF，n=

6、24)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)。3、免疫熒光染色顯示經(jīng)過GB及FGF誘導(dǎo)的細(xì)胞，神經(jīng)特異性標(biāo)志物GFAP、NSE、CHAT陽性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)量較PBS組增加。免疫熒光染色陽性細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù)顯示，各組細(xì)胞免疫熒光結(jié)果在GB組中GFAP、CHAT、NSE陽性細(xì)胞數(shù)較PBS組明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P(O．05)；GB各劑量組中陽性細(xì)胞數(shù)較FGF組差異無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0．05)。GB組問比較無明顯差異性(P>0．05)。結(jié)論1．經(jīng)GB誘導(dǎo)的BMSCs，不僅具有神經(jīng)樣細(xì)胞的外形和免疫學(xué)特征，而且具有神經(jīng)元相

7、類似的基本電生理功能和神經(jīng)遞質(zhì)的合成功能。2．GB誘導(dǎo)的BMSCs可以同時(shí)表達(dá)向多種神經(jīng)樣細(xì)胞分化方向神經(jīng)標(biāo)志物，且其陽性率均較高，表明短期誘導(dǎo)的BMSCs細(xì)胞具有了定向向神經(jīng)樣細(xì)胞分化的干細(xì)胞特征。3．銀杏內(nèi)酯B可誘導(dǎo)BMSCs向神經(jīng)樣細(xì)胞分化。關(guān)鍵詞：銀杏內(nèi)酯B；BMSCs；轉(zhuǎn)分化；膜片鉗；免疫熒光染色徐州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文TheinductionofGinkgolideBinSDrats’bonemarrowmesencaymestemcellsintoneuron-liRecellsinvitrolll●

8、l●ll’●‘·AbstractObjectiveToinvestigatetheinductionoftheGinkgolideBtoSpragueDawleyrats’bonemarrowmesenchymestemcellsintoneuron，weutilizedlaboratorytechniquetodetect*henero,’e—likecell?Sfun