bfgf與egf誘導(dǎo)bmscs向神經(jīng)干細胞分化的觀察

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1、bFGF與EGF誘導(dǎo)BMSCs向神經(jīng)干細胞分化的觀察：倫鵬孟慶海劉廣義【關(guān)鍵詞】bFGF［摘要］目的探討堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）、表皮生長因子（EGF）在體外條件下對骨髓基質(zhì)干細胞（BMSCs）向神經(jīng)干細胞（NSCs）和神經(jīng)樣細胞分化的誘導(dǎo)作用。方法采用出生4周左右大鼠的全骨髓細胞進行培養(yǎng)，傳至第3代時，分為兩組:實驗組細胞加入bFGF和EGF，進行誘導(dǎo)分化；對照組不加因子繼續(xù)培養(yǎng)。在倒置顯微鏡下每日觀察、記錄BMSCs的誘導(dǎo)分化情況，并應(yīng)用免疫組化技術(shù)對細胞進行兔抗巢蛋白（Nestin）單抗、兔抗神

2、經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）單抗、兔抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）單抗鑒定。結(jié)果實驗組誘導(dǎo)7d后有部分細胞具備神經(jīng)元樣細胞形態(tài)，胞體錐形或圓形，有較長單極或多極的突起，均有Nestin、NSE、GFAP陽性細胞表達，且3種細胞數(shù)量差別有顯著性（t=3.266~6.099,P<0.05）。而對照組細胞仍為典型的成纖維細胞形態(tài)，無Nestin、NSE、GFAP陽性細胞。結(jié)論bFGF、EGF可以誘導(dǎo)BMSCs向NSCs分化，并可調(diào)控神經(jīng)元分化，促進神經(jīng)元細胞成熟。［關(guān)鍵詞］骨髓細胞;干細胞;成纖維細胞生長因子;

3、表皮生長因子;巢蛋白［ABSTRACT］ObjectiveTostudyarroalcells(BMSCs)couldbeinducedtodifferentiateintoneuralstemcells(NSCs)andneuronsbybasicfibroblastgroalgroarroalcellsbonemarroicroscopemunohistochemistrytechniqueeBMSCsappearedtypicalmorphologicalneuronaltraits:therefract

4、ileandconelikeorsphericalcellbodiesandlongprocesses,expressedNestinorNSEorGFAP.Thethreekindsofcellsshoightregulatethedifferentiationandpromotethematurationofneurons.［KEYEM/F12培養(yǎng)液反復(fù)沖洗骨髓腔，沖洗液收集于無菌離心管中，得到細胞懸液1000r/min離心3min。棄去上清液，加入體積分數(shù)0.10血清培養(yǎng)液，充分吹打至單細胞懸液，調(diào)細胞濃

5、度為4×108/L,接種于培養(yǎng)瓶中。置于37℃、體積分數(shù)0.05CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48h后全量換液，去除未貼壁細胞。以后每3~4d換液一次，待細胞長至80％~90％融合后，用含0.2g/LEDTA及0.25g/L胰酶的消化液消化，以細胞密度4×108/L接種傳代。1.3誘導(dǎo)和分化傳至第3代時，分為實驗組和對照組。實驗組加入bFGF、EGF（終質(zhì)量濃度200ng/L）培養(yǎng)。對照組不加bFGF、EGF，用原培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。每日觀察、記錄細胞生長情況。1.4細胞免疫組化染色及觀察bFGF、EGF誘導(dǎo)培養(yǎng)后第6天，調(diào)

6、細胞濃度為4×108/L，分別將兩組細胞接種入24孔培養(yǎng)板，每孔0.5mL，貼壁24h后，40g/L多聚甲醛固定，分別進行Nestin、NSE、GFAP免疫組化鑒定，DAB顯色，倒置顯微鏡下拍照記錄，細胞漿呈棕黃色者為陽性細胞。SABC法鑒定細胞成分：一抗分別為Nestin單抗、NSE單抗、GFAP單抗；二抗為羊抗兔或鼠IgG，以確定誘導(dǎo)分化的細胞是否為神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞。DAB顯色法染色，著棕黃色的細胞判定為陽性。陽性對照為星形細胞瘤和神經(jīng)元腫瘤，陰性對照孔不加一抗。倒置光學(xué)顯微鏡下觀察。高倍鏡（400倍）下，

7、在每孔的中心和四周隨機選擇5個視野，進行細胞計數(shù)，結(jié)果以±s表示，數(shù)據(jù)間比較采用t檢驗。2結(jié)果2.1BMSCs的形態(tài)BMSCs培養(yǎng)24h后可見細胞貼壁，但混雜有大量紅細胞。48h換液后可除去紅細胞，其余貼壁細胞于3~4d后進入對數(shù)增長期，細胞呈集落樣生長，形成多個克隆團樣結(jié)構(gòu)，10d左右達到80％~90％融合。倒置顯微鏡下觀察，細胞主要有兩種形態(tài)：下層為梭形和多角形的成纖維細胞，體積較大，約占90％左右；另有較少的小圓形的多形細胞，折光率較高。3討論bFGF是一種廣譜的神經(jīng)營養(yǎng)因子，胚胎期腦內(nèi)的含量很高［2］。

8、EGF在發(fā)育腦和成年腦內(nèi)均有表達，神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞均可表達EGF。有實驗證實，bFGF能促進神經(jīng)元前體細胞的存活或使NSCs向神經(jīng)元前體細胞分化增殖，從而導(dǎo)致NSCs分化為神經(jīng)元的比例增多［3］，而EGF則主要刺激膠質(zhì)前體細胞增殖［4］。但體外實驗證實，EGF能促使NSCs存活和增殖，且EGF在NSCs增殖后期發(fā)揮作用［5］。bFGF和EGF不只是起到有絲分裂原的作用，也可促進細胞