hgf及egf體外誘導(dǎo)vegf165基因修飾bmscs向肝細(xì)胞分化的研究

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1、分類(lèi)號(hào)VDC博士學(xué)位論文編號(hào)HGF及EGF體外誘導(dǎo)VEGFl65基因修飾BMSCs向肝細(xì)胞分化的研究VEGFl6sExpressingBoneMarrowMesenchymalStemCellsDifferentiateintoHepatocytesUnderHGFandEGFInductioninvitro作者姓名：學(xué)科專(zhuān)業(yè)：指導(dǎo)老師：學(xué)院(系、所)：譚艷影像醫(yī)學(xué)與核醫(yī)學(xué)肖恩華湘雅二醫(yī)院答辯委員會(huì)主席中南大學(xué)二零一二年三月一令一一，平二月原創(chuàng)性聲明本文聲明，所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除了論文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包

2、含其他人已經(jīng)發(fā)表中撰寫(xiě)過(guò)的研究成果，也不包含為獲得中南或其他單位的學(xué)位或證書(shū)而使用過(guò)的材料。與我共同工作的同志對(duì)本研究所作的貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說(shuō)明。作者：日期：盈墮年五月掣日關(guān)于學(xué)位論文使用授權(quán)說(shuō)明本文了解中南大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：學(xué)校有權(quán)保留學(xué)位論文，允許學(xué)位論文被查閱和借閱；學(xué)校可以公布學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容，可以采用復(fù)印、縮印或其它手段保存學(xué)位論文；學(xué)校可根據(jù)國(guó)家或湖南省有關(guān)部門(mén)規(guī)定送交學(xué)位論文。日期：壟墮年互月丑日博士學(xué)位論文中文摘要第一章骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)、生物學(xué)鑒定及VEGF．髓質(zhì)粒的擴(kuò)增目的：1．建立兔骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSCs)體外分離、

3、培養(yǎng)、增殖、凍存的方法，以及探討其生物學(xué)特性。2．VEGF。髓一pCMv6一AC—GFP質(zhì)粒的擴(kuò)增及鑒定。方法：采用密度梯度離心法結(jié)合貼壁培養(yǎng)法分離純化、擴(kuò)增BMSCs，用流式細(xì)胞學(xué)及免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定BMSCs，光學(xué)顯微鏡及掃描電鏡觀察BMSCs的細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)特性，測(cè)定第1、3、5代BMSCs及l(fā)o％、15％、25％FBS培養(yǎng)第3代BMSCs的生長(zhǎng)曲線。BMSCs在IO％DMSO條件下經(jīng)液氮或-60。C凍存復(fù)蘇，測(cè)其成活率及增殖能力。VEGF?？嵋籶CMv6_AC-GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌并擴(kuò)增、抽提，檢測(cè)濃度及純度。結(jié)果：BMSCs為貼壁生長(zhǎng)，呈均一的梭形成纖維細(xì)胞樣，流式細(xì)胞學(xué)

4、顯示BMSCs明顯表達(dá)CD29(93．41％±3．2％，n-3)和CD44(91．55％±4．1％)，而不表達(dá)CD45(3．95％±2．9％)和CD34(3．36％±3．．6％)，免疫細(xì)胞化學(xué)顯示CD29和CD44表達(dá)陽(yáng)性，CD45和CD34呈陰性。BMSCs生長(zhǎng)曲線呈S型，l-3d為潛伏期，生長(zhǎng)較慢；3d后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，步入快速增長(zhǎng)；7-8d為平臺(tái)期，細(xì)胞增殖速度趨于平緩。以15％FBS及第1代BMSCs生長(zhǎng)狀態(tài)最佳。BMSCs復(fù)蘇后細(xì)胞活力達(dá)90％以上，其生長(zhǎng)形態(tài)與凍存前無(wú)明顯差異，可用于后續(xù)試驗(yàn)研究。提取的VEGF。∞一pCMV6-AC—GFP質(zhì)粒的純度、濃度分別為1．83

5、，0．75ug／ul，可應(yīng)用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染試驗(yàn)研究。結(jié)論：1．采用密度梯度離心法結(jié)合貼壁培養(yǎng)法分離純化、擴(kuò)增BMSCs可行。2．兔BMSCs增殖能力強(qiáng)，易體外分離、純化、擴(kuò)增，傳代的BMSCs可保持其原有的生物學(xué)特性。3．凍存后復(fù)蘇的BMSCs仍有較強(qiáng)的增殖能博士學(xué)位論文中文摘要力。4．成功擴(kuò)增高純度的VEGF．pCMV6一AC—GFP質(zhì)粒。關(guān)鍵詞：兔，BMSCs，生長(zhǎng)曲線，凍存，VEGF嫡質(zhì)粒第二章構(gòu)建vEGF。髓_pC肼6-AC—GFP基因修飾的BMSCs目的：比較脂質(zhì)體2000及電穿孔兩種轉(zhuǎn)染方法，為BMSCs基因轉(zhuǎn)染提供可行方案，并建立最佳的轉(zhuǎn)染條件。方法：1．體外分離、擴(kuò)增兔

6、BMSCs，分別用脂質(zhì)體2000、電穿孔轉(zhuǎn)染第3代BMSCs，用顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化及GFP熒光表達(dá)，繪制生長(zhǎng)曲‘線觀察細(xì)胞的增殖能力，用細(xì)胞流式法比較兩種方法的轉(zhuǎn)染效率。2．選擇可行方案并優(yōu)化轉(zhuǎn)染參數(shù)，通過(guò)選擇不同的電穿孔緩沖液(Opti-DMEM，含血清全培養(yǎng)基及D-Hanks液)，選擇不同的電壓(250V，280V，310V)，不同的質(zhì)粒量(20ug，50ug,70ug)的條件下進(jìn)行電轉(zhuǎn)，用顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化及GFP熒光表達(dá)，用細(xì)胞流式法比較兩種方法的轉(zhuǎn)染效率。3．以最優(yōu)轉(zhuǎn)染參數(shù)電轉(zhuǎn)BMSCs后，用200ug／mlG418篩選電轉(zhuǎn)后48h的BMSCs，用RT_PCR

7、檢測(cè)BMSCs電轉(zhuǎn)后不同時(shí)間點(diǎn)VEGF。衢的表達(dá)情況。用單因素方差分析所得數(shù)據(jù)，以a=O．05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。結(jié)果：脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染后BMSCs的GFP熒光數(shù)稀少，電穿孔轉(zhuǎn)染的GFP熒光數(shù)較多，轉(zhuǎn)染效率分別為5．12％、17．3％。脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染后BMSCs生長(zhǎng)曲線呈水平下降型，細(xì)胞幾乎沒(méi)有增殖，后期細(xì)胞逐漸死亡，電穿孔轉(zhuǎn)染后BMSCs生長(zhǎng)曲線仍呈S型。Opti—DMEM，含血清DMEM及D-Hanks液電穿孔轉(zhuǎn)染效率分別是15．27％，10．53％，13．9i％。