hgf及egf體外誘導(dǎo)vegf165基因修飾bmscs向肝細胞分化的研究

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1、分類號VDC博士學(xué)位論文編號HGF及EGF體外誘導(dǎo)VEGFl65基因修飾BMSCs向肝細胞分化的研究VEGFl6sExpressingBoneMarrowMesenchymalStemCellsDifferentiateintoHepatocytesUnderHGFandEGFInductioninvitro作者姓名：學(xué)科專業(yè)：指導(dǎo)老師：學(xué)院(系、所)：譚艷影像醫(yī)學(xué)與核醫(yī)學(xué)肖恩華湘雅二醫(yī)院答辯委員會主席中南大學(xué)二零一二年三月一令一一，平二月原創(chuàng)性聲明本文聲明，所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除了論文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包

2、含其他人已經(jīng)發(fā)表中撰寫過的研究成果，也不包含為獲得中南或其他單位的學(xué)位或證書而使用過的材料。與我共同工作的同志對本研究所作的貢獻均已在論文中作了明確的說明。作者：日期：盈墮年五月掣日關(guān)于學(xué)位論文使用授權(quán)說明本文了解中南大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：學(xué)校有權(quán)保留學(xué)位論文，允許學(xué)位論文被查閱和借閱；學(xué)校可以公布學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容，可以采用復(fù)印、縮印或其它手段保存學(xué)位論文；學(xué)?？筛鶕?jù)國家或湖南省有關(guān)部門規(guī)定送交學(xué)位論文。日期：壟墮年互月丑日博士學(xué)位論文中文摘要第一章骨髓間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)、生物學(xué)鑒定及VEGF．髓質(zhì)粒的擴增目的：1．建立兔骨髓基質(zhì)細胞(BMSCs)體外分離、

3、培養(yǎng)、增殖、凍存的方法，以及探討其生物學(xué)特性。2．VEGF。髓一pCMv6一AC—GFP質(zhì)粒的擴增及鑒定。方法：采用密度梯度離心法結(jié)合貼壁培養(yǎng)法分離純化、擴增BMSCs，用流式細胞學(xué)及免疫細胞化學(xué)鑒定BMSCs，光學(xué)顯微鏡及掃描電鏡觀察BMSCs的細胞形態(tài)及生長特性，測定第1、3、5代BMSCs及l(fā)o％、15％、25％FBS培養(yǎng)第3代BMSCs的生長曲線。BMSCs在IO％DMSO條件下經(jīng)液氮或-60。C凍存復(fù)蘇，測其成活率及增殖能力。VEGF?？嵋籶CMv6_AC-GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌并擴增、抽提，檢測濃度及純度。結(jié)果：BMSCs為貼壁生長，呈均一的梭形成纖維細胞樣，流式細胞學(xué)

4、顯示BMSCs明顯表達CD29(93．41％±3．2％，n-3)和CD44(91．55％±4．1％)，而不表達CD45(3．95％±2．9％)和CD34(3．36％±3．．6％)，免疫細胞化學(xué)顯示CD29和CD44表達陽性，CD45和CD34呈陰性。BMSCs生長曲線呈S型，l-3d為潛伏期，生長較慢；3d后進入對數(shù)生長期，步入快速增長；7-8d為平臺期，細胞增殖速度趨于平緩。以15％FBS及第1代BMSCs生長狀態(tài)最佳。BMSCs復(fù)蘇后細胞活力達90％以上，其生長形態(tài)與凍存前無明顯差異，可用于后續(xù)試驗研究。提取的VEGF?！抟籶CMV6-AC—GFP質(zhì)粒的純度、濃度分別為1．83

5、，0．75ug／ul，可應(yīng)用于細胞轉(zhuǎn)染試驗研究。結(jié)論：1．采用密度梯度離心法結(jié)合貼壁培養(yǎng)法分離純化、擴增BMSCs可行。2．兔BMSCs增殖能力強，易體外分離、純化、擴增，傳代的BMSCs可保持其原有的生物學(xué)特性。3．凍存后復(fù)蘇的BMSCs仍有較強的增殖能博士學(xué)位論文中文摘要力。4．成功擴增高純度的VEGF．pCMV6一AC—GFP質(zhì)粒。關(guān)鍵詞：兔，BMSCs，生長曲線，凍存，VEGF嫡質(zhì)粒第二章構(gòu)建vEGF。髓_pC肼6-AC—GFP基因修飾的BMSCs目的：比較脂質(zhì)體2000及電穿孔兩種轉(zhuǎn)染方法，為BMSCs基因轉(zhuǎn)染提供可行方案，并建立最佳的轉(zhuǎn)染條件。方法：1．體外分離、擴增兔

6、BMSCs，分別用脂質(zhì)體2000、電穿孔轉(zhuǎn)染第3代BMSCs，用顯微鏡觀察細胞形態(tài)學(xué)變化及GFP熒光表達，繪制生長曲‘線觀察細胞的增殖能力，用細胞流式法比較兩種方法的轉(zhuǎn)染效率。2．選擇可行方案并優(yōu)化轉(zhuǎn)染參數(shù)，通過選擇不同的電穿孔緩沖液(Opti-DMEM，含血清全培養(yǎng)基及D-Hanks液)，選擇不同的電壓(250V，280V，310V)，不同的質(zhì)粒量(20ug，50ug,70ug)的條件下進行電轉(zhuǎn)，用顯微鏡觀察細胞形態(tài)學(xué)變化及GFP熒光表達，用細胞流式法比較兩種方法的轉(zhuǎn)染效率。3．以最優(yōu)轉(zhuǎn)染參數(shù)電轉(zhuǎn)BMSCs后，用200ug／mlG418篩選電轉(zhuǎn)后48h的BMSCs，用RT_PCR

7、檢測BMSCs電轉(zhuǎn)后不同時間點VEGF。衢的表達情況。用單因素方差分析所得數(shù)據(jù)，以a=O．05為檢驗水準(zhǔn)。結(jié)果：脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染后BMSCs的GFP熒光數(shù)稀少，電穿孔轉(zhuǎn)染的GFP熒光數(shù)較多，轉(zhuǎn)染效率分別為5．12％、17．3％。脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染后BMSCs生長曲線呈水平下降型，細胞幾乎沒有增殖，后期細胞逐漸死亡，電穿孔轉(zhuǎn)染后BMSCs生長曲線仍呈S型。Opti—DMEM，含血清DMEM及D-Hanks液電穿孔轉(zhuǎn)染效率分別是15．27％，10．53％，13．9i％。