資源描述：
《奶牛源隱孢子蟲(chóng)的鑒定及隱孢子蟲(chóng)囊壁蛋白基因的克隆》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫(kù)。
1、安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文奶牛源隱孢子蟲(chóng)的鑒定及隱孢子蟲(chóng)囊壁蛋白基因的克隆姓名：孫濤申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專(zhuān)業(yè)：預(yù)防獸醫(yī)學(xué)指導(dǎo)教師：李培英；張丹俊201205摘要隱孢子蟲(chóng)病(Cryptosporidisis)是由隱孢子蟲(chóng)f1C仰fD印Dr泐材圳感染引起的一種全球性人畜共患寄生蟲(chóng)病。隱孢子蟲(chóng)是人和動(dòng)物腹瀉的重要病原之一，也是人類(lèi)艾滋病患者的主要致死因素之一。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)隱孢子蟲(chóng)病進(jìn)行了較廣泛而深入的研究，但合肥地區(qū)隱孢子蟲(chóng)種類(lèi)尚不清楚。本課題旨在通過(guò)對(duì)合肥地區(qū)某奶牛場(chǎng)奶牛糞樣中隱孢子蟲(chóng)的檢查，獲取隱孢子蟲(chóng)感染陽(yáng)性奶牛，從陽(yáng)性奶牛糞樣中分離出隱孢子蟲(chóng)卵囊，采用形態(tài)學(xué)
2、和分子生物學(xué)方法進(jìn)行隱孢子蟲(chóng)蟲(chóng)種鑒定，為隱孢子蟲(chóng)病的防治提供理論依據(jù)；提取隱孢子蟲(chóng)卵囊的總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得隱孢子蟲(chóng)cDNA，擴(kuò)增隱孢子蟲(chóng)囊壁蛋白基因，以期為篩選研制隱孢子蟲(chóng)疫苗的抗原候選分子提供資料。首先采用飽和蔗糖溶液漂浮法和改良抗酸染色法對(duì)合肥地區(qū)某奶牛場(chǎng)285頭成年母牛糞樣進(jìn)行隱孢子蟲(chóng)卵囊檢測(cè)，飽和蔗糖溶液漂浮法檢出隱孢子蟲(chóng)陽(yáng)性奶牛5頭，其感染率為1．8％；改良抗酸染色法檢出隱孢子蟲(chóng)陽(yáng)性奶牛6頭，感染率為2．1％。根據(jù)隱孢子蟲(chóng)卵囊的形態(tài)、大小和卵形指數(shù)(長(zhǎng)／寬)等特征對(duì)所獲蟲(chóng)體進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，飽和蔗糖溶液漂浮法檢獲的卵囊為橢圓形或卵圓形，大小平均為7．
3、37um×6．13岬，卵形指數(shù)為1．20；改良抗酸染色法檢獲的卵囊為橢圓形或卵圓形，呈玫瑰紅色，周?chē)钊?，中央淡染，大小平均?．58肛m×6．20¨m，卵形指數(shù)為1．22，初步鑒定飽和蔗糖溶液漂浮法和改良抗酸染色法檢出的隱孢子蟲(chóng)均為安氏隱孢子蟲(chóng)(cryptosporiditlmnndersoni)o其次采集飽和蔗糖溶液漂浮法和改良抗酸染色法檢測(cè)均為隱孢子蟲(chóng)陽(yáng)性的5頭奶牛糞樣，分離隱孢子蟲(chóng)卵囊。根據(jù)隱孢子蟲(chóng)18srIⅢA基因和HsP70基因序列分別設(shè)計(jì)2對(duì)PCR反應(yīng)引物和2對(duì)巢式PCR反應(yīng)引物，以所獲卵囊基因組為模板分別進(jìn)行PCR反應(yīng)和巢式PCR反應(yīng)，對(duì)巢式PCR
4、反應(yīng)的產(chǎn)物進(jìn)行膠回收、克隆和測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與隱孢子蟲(chóng)有效蟲(chóng)種的18SrIⅢA基因和HSP70基因序列進(jìn)行同源性分析和進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建，從而確定所獲隱孢子蟲(chóng)的種類(lèi)。結(jié)果顯示PCR擴(kuò)增出的隱孢予蟲(chóng)18SrRNA基因和HSP70基因片段分別為540bp和448bp，巢式PCR擴(kuò)增出的隱孢子蟲(chóng)18SrIⅢA基因和HSP70基因片段分別為250bp和325bp(GenBank登錄號(hào)分別為JQ031803、JQ031804、JQ031805、JQ031806、JQ031807、JQ031808、JQ031809、JQ031810、JQ0318ll、JQ031812)，與預(yù)期片段大
5、小基本一致；將巢式PCR產(chǎn)物序列與隱孢子蟲(chóng)相關(guān)序列進(jìn)行同源性分析發(fā)現(xiàn)，這5株分離株18srRNA基因與安氏隱孢子蟲(chóng)仰fo印Drf旃”ma船如坶D”砂DQ989573序列一致性最高，兩者在系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)上為同一分支；這5株分離株的HSP70基因片段與安氏隱孢子蟲(chóng)AY954892和D0989576序列一致性最高，且在系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)上為同一分支，因此確定所分離的5株奶牛源隱孢子蟲(chóng)分離株均為安氏隱孢子蟲(chóng)作乃矽幻．驢D，洶甜聊口玎沈坶D”f)。最后采集安氏隱孢子蟲(chóng)陽(yáng)性奶牛的新鮮糞樣，提取隱孢子蟲(chóng)總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以單鏈cDNA為模板擴(kuò)增出安氏隱孢子蟲(chóng)囊壁蛋白基因部分片段
6、，并進(jìn)行克隆、測(cè)序，將測(cè)序所得序列與GeneBank已發(fā)布的隱孢子蟲(chóng)囊壁蛋白基因序列進(jìn)行序列比對(duì)，從而確定隱孢子蟲(chóng)囊壁蛋白基因的突變情況。通過(guò)反轉(zhuǎn)錄和PCR方法擴(kuò)增出安氏隱孢子蟲(chóng)囊壁蛋白基因499bp片段，經(jīng)克隆、測(cè)序及序列分析，此次擴(kuò)增出的CoWP序列與登陸號(hào)為D0989570的囊壁蛋白序列同源性為100％。綜上所述，本研究獲得了合肥奶牛隱孢子蟲(chóng)分離株及其18SrRNA和HsP70基因片段，為中國(guó)隱孢子蟲(chóng)病的臨床診斷、分子生物學(xué)檢測(cè)及蟲(chóng)種鑒定提供了依據(jù)；擴(kuò)增出的奶牛源安氏隱孢子蟲(chóng)囊壁蛋白基因，為今后隱孢子蟲(chóng)疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：隱孢子蟲(chóng)，蟲(chóng)種鑒定，囊壁蛋
7、白，奶牛AbstractC拶ptosporidiosisisaglobalzoonoticparasiticdiseasecausedby(功幻印D，．￡擊甜所，、^，hichcaninf．ectedpeopleandanimals．(功fD置pDr死矗h，"isoneoftheimportantpathogenfordia—1eainhumansandanimals．ItisalsooneoftIlemaincauseofdeatllofthehumanAIDSpatients．Inrecentyears，dispitescholarshaVeamoreexte
8、nsiVe
