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《山羊c-myc基因的原核表達及多克隆抗體和單克隆抗體的制備》由會員上傳分享,免費在線閱讀,更多相關(guān)內(nèi)容在學術(shù)論文-天天文庫。
1、廣西大學碩士學位論文山羊c--Myc基因的原核表達及多克隆抗體和單克隆抗體的制備姓名:張昀申請學位級別:碩士專業(yè):臨床獸醫(yī)學指導教師:鄭喜邦20120628山羊c-Myc基因的原核表達及多克隆抗體和單克隆抗體的制備摘要c—Myc是一種重要的原癌基因,它可以作為一種轉(zhuǎn)錄因子,在維持胚胎干細胞的生物學特性和誘導多性干細胞(inducedpluripotentstemcells,iPS)形成的過程中發(fā)揮重要的作用。因此制備其相應的多克隆抗體和單克隆抗體非常必要,這將為進一步研究山羊ES細胞和iPS細胞的自我更新機制奠定基礎(chǔ)。試驗1.以pMDl8T-Myc質(zhì)粒為模版,P
2、CR擴增c.Myc片段,然后將其亞克隆到pSE380表達載體上,獲得pSE380.Myc重組質(zhì)粒。該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化工程茵B(yǎng)L21(DE3),IPTG誘導表達His.Myc融合蛋白,隨后用SDS.PAGE電泳及Westernblot加以驗證。在變性條件下用Ni.NTAargrose介質(zhì)分離純化His.Myc融合蛋白,并以此為抗原皮下注射新西蘭大白兔,間隔2.3周注射1次,共4次。最后一次免疫后7天,采血分離血清,用Westernblot檢測抗體特異性。結(jié)果表明:(1)pSE380.Myc重組質(zhì)粒在工程菌BL21(DE3)得到了高效表達;(2)得到了高純度高含量的His.
3、Myc融合蛋白;獲得的多克隆抗體與His.Myc融合蛋白能夠特異性結(jié)合。結(jié)論:本試驗成功獲得了特異性山羊c.Myc多克隆抗體。試驗2.利用上述純化的His.Myc融合蛋白做為抗原,免疫7-9周齡的雌性BALB/C小鼠,經(jīng)過四次免疫后取小鼠脾臟細胞與SP2/0骨髓瘤細胞進行細胞融合。采用間接ELISA法篩選陽性雜交瘤細胞,應用有限稀釋法對其進行3.4次亞克隆,獲得穩(wěn)定分泌抗C.Myc蛋白抗體的雜交瘤細胞株,并將其腹腔注射BALB/C小鼠。7—1O天后采集腹水,間接ELISA測定腹水抗體效價,以單克隆抗體亞類鑒定試劑盒測定抗體亞類。結(jié)果表明:(1)獲得了穩(wěn)定分泌抗C
4、.Myc蛋白抗體的雜交瘤細胞株,分別命名為1F10、2H10和3810,培養(yǎng)液上清抗體效價分別為1:10000、1:8000、1:6000。(2)1F10、2H10兩株雜交瘤細胞在小鼠體內(nèi)誘生的腹水抗體效價分別為1:1280000和1:640000,抗體亞類均屬于IgG1類。(3)核型分析表明,雜交瘤細胞的染色體眾數(shù)為90—100。(4)間接ELISA顯示,上述3雜交瘤細胞株體外傳代和凍存復蘇后的培養(yǎng)液上清OD值基本保持不變,抗體分泌穩(wěn)定,證明山羊c。Myc單克隆抗體制備取得滿意結(jié)果。關(guān)鍵詞:山羊c_Myc基因多克隆抗體分子克隆原核表達蛋白純化單克隆抗體Prok
5、aryoticExpressionofc—MycGeneandPreparationofPolyclonalAnti-—C·-MycAntibodyandMonoclonalAnti—-C--MycAntibodyinCapraHircusABSTRACTc—Mycisaimportantprotoncogene.Asakindoftranscriptionfactors,Itplaysanimportantroleinmaintainingbiologicalcharacteristicsofembryonicstemcells(EScells)andindu
6、cedpluripotentstemcells(iPScells).Itisurgentlynecessarytoprepareitspolyclonalandmonoclonalanti·-C-·MycantibodyinCapraHircus,whichwillleadtofurtherstudyself-renewmechanismofEScellsandiPScellsinCapraHircus.1.TheplasmidpMD18T—Mycwasusedastempletetoamplifyc—Myc—fragment,whichwassubcloned
7、tovectorpSE380toconstructrecombinantplasmidpSE380一Myc.TheplasmidwasthentransformedintoEcoli.BL21(DE3),andHis-Mycfusionproteinwasexpressed而minductionofIPTG,whichWassubsequentlyverifiedbySDS—PAGEandWesternblotassay.PurifiedwithNi-NTAargroseunderdenaturingconditon,His.Mycfusionproteinwa
8、susedasantig