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1、廣西大學(xué)碩士學(xué)位論文山羊c--Myc基因的原核表達(dá)及多克隆抗體和單克隆抗體的制備姓名：張昀申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：臨床獸醫(yī)學(xué)指導(dǎo)教師：鄭喜邦20120628山羊c-Myc基因的原核表達(dá)及多克隆抗體和單克隆抗體的制備摘要c—Myc是一種重要的原癌基因，它可以作為一種轉(zhuǎn)錄因子，在維持胚胎干細(xì)胞的生物學(xué)特性和誘導(dǎo)多性干細(xì)胞(inducedpluripotentstemcells，iPS)形成的過程中發(fā)揮重要的作用。因此制備其相應(yīng)的多克隆抗體和單克隆抗體非常必要，這將為進(jìn)一步研究山羊ES細(xì)胞和iPS細(xì)胞的自我更新機(jī)制奠定基礎(chǔ)。試驗(yàn)1．以pMDl8T-Myc質(zhì)粒為模版，P
2、CR擴(kuò)增c．Myc片段，然后將其亞克隆到pSE380表達(dá)載體上，獲得pSE380．Myc重組質(zhì)粒。該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化工程茵B(yǎng)L21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)His．Myc融合蛋白，隨后用SDS．PAGE電泳及Westernblot加以驗(yàn)證。在變性條件下用Ni．NTAargrose介質(zhì)分離純化His．Myc融合蛋白，并以此為抗原皮下注射新西蘭大白兔，間隔2．3周注射1次，共4次。最后一次免疫后7天，采血分離血清，用Westernblot檢測(cè)抗體特異性。結(jié)果表明：(1)pSE380．Myc重組質(zhì)粒在工程菌BL21(DE3)得到了高效表達(dá)；(2)得到了高純度高含量的His．
3、Myc融合蛋白；獲得的多克隆抗體與His．Myc融合蛋白能夠特異性結(jié)合。結(jié)論：本試驗(yàn)成功獲得了特異性山羊c．Myc多克隆抗體。試驗(yàn)2．利用上述純化的His．Myc融合蛋白做為抗原，免疫7-9周齡的雌性BALB／C小鼠，經(jīng)過四次免疫后取小鼠脾臟細(xì)胞與SP2／0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合。采用間接ELISA法篩選陽性雜交瘤細(xì)胞，應(yīng)用有限稀釋法對(duì)其進(jìn)行3．4次亞克隆，獲得穩(wěn)定分泌抗C．Myc蛋白抗體的雜交瘤細(xì)胞株，并將其腹腔注射BALB／C小鼠。7—1O天后采集腹水，間接ELISA測(cè)定腹水抗體效價(jià)，以單克隆抗體亞類鑒定試劑盒測(cè)定抗體亞類。結(jié)果表明：(1)獲得了穩(wěn)定分泌抗C
4、．Myc蛋白抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為1F10、2H10和3810，培養(yǎng)液上清抗體效價(jià)分別為1：10000、1：8000、1：6000。(2)1F10、2H10兩株雜交瘤細(xì)胞在小鼠體內(nèi)誘生的腹水抗體效價(jià)分別為1：1280000和1：640000，抗體亞類均屬于IgG1類。(3)核型分析表明，雜交瘤細(xì)胞的染色體眾數(shù)為90—100。(4)間接ELISA顯示，上述3雜交瘤細(xì)胞株體外傳代和凍存復(fù)蘇后的培養(yǎng)液上清OD值基本保持不變，抗體分泌穩(wěn)定，證明山羊c。Myc單克隆抗體制備取得滿意結(jié)果。關(guān)鍵詞：山羊c_Myc基因多克隆抗體分子克隆原核表達(dá)蛋白純化單克隆抗體Prok
5、aryoticExpressionofc—MycGeneandPreparationofPolyclonalAnti-—C·-MycAntibodyandMonoclonalAnti—-C--MycAntibodyinCapraHircusABSTRACTc—Mycisaimportantprotoncogene．Asakindoftranscriptionfactors，Itplaysanimportantroleinmaintainingbiologicalcharacteristicsofembryonicstemcells(EScells)andindu
6、cedpluripotentstemcells(iPScells)．Itisurgentlynecessarytoprepareitspolyclonalandmonoclonalanti·-C-·MycantibodyinCapraHircus，whichwillleadtofurtherstudyself-renewmechanismofEScellsandiPScellsinCapraHircus．1．TheplasmidpMD18T—Mycwasusedastempletetoamplifyc—Myc—fragment，whichwassubcloned
7、tovectorpSE380toconstructrecombinantplasmidpSE380一Myc．TheplasmidwasthentransformedintoEcoli．BL21(DE3)，andHis-Mycfusionproteinwasexpressed而minductionofIPTG，whichWassubsequentlyverifiedbySDS—PAGEandWesternblotassay．PurifiedwithNi-NTAargroseunderdenaturingconditon，His．Mycfusionproteinwa
8、susedasantig
