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《擬蜘蛛牽絲蛋白基因的原核表達(dá)及多克隆抗體制備》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)研究生學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)聲明本人申明所呈交的學(xué)位論文是我本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包括其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包括為獲得我?；蚱渌逃龣C(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料，與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明并表示謝意。申請學(xué)位論文與資料若有不實(shí)之處，本人承擔(dān)一切相關(guān)責(zé)任。論文作者簽名：一彥多日期：塑!絲：曼：!!內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)研究生學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書本人完全了解內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)有關(guān)保護(hù)知識產(chǎn)權(quán)的規(guī)定，即：研究生在攻讀學(xué)位期間
2、論文工作的知識產(chǎn)權(quán)單位屬內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)。本人保證畢業(yè)離校后，發(fā)表論文或使用論文工作成果時(shí)署名單位為內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，且導(dǎo)師為通訊作者，通訊作者單位亦署名為內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)。學(xué)校有權(quán)保留并向國家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子文檔，允許論文被查閱和借閱。學(xué)?？梢怨紝W(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容(保密內(nèi)容除外)，采用影印、縮印或其他手段保存論文。論文作者簽名：指導(dǎo)教師簽名：玩零日期：2,o!¨I叩摘要蜘蛛牽絲因其優(yōu)異的機(jī)械性能越來越多地作為材料應(yīng)用于醫(yī)療、建筑等領(lǐng)域。但天然蛛絲產(chǎn)量低，利用原核生物反應(yīng)器生產(chǎn)重組蛛絲是目前人工獲得大量蛛絲的有效手段。本研究用
3、擬蜘蛛牽絲蛋白基因單體(S)和二聚體(2S)分別構(gòu)建了原核表達(dá)載體pGEX—S和pGEX一2S，轉(zhuǎn)化大腸桿菌并誘導(dǎo)其表達(dá)，用產(chǎn)量多的重組蛋白為抗原，免疫小白鼠以制備抗血清。通過此方法可以探索建立適宜的重組蛛絲原核表達(dá)體系，也為檢測其在真核表達(dá)提供材料。主要研究結(jié)果如下：1．?dāng)M蜘蛛牽絲蛋白基因序列的合成：根據(jù)棒絡(luò)新婦蛛的cDNA片段人工合成擬蜘蛛牽絲蛋白基因單體(D，并構(gòu)建了二聚體(2S)。2．原核表達(dá)載體的構(gòu)建：基因單體(剛合成后與克隆載體pUC57相連，得到重組質(zhì)粒pUC57一S再通過酶切、連接、轉(zhuǎn)化等合成二聚體(2S)；分別將S和2,9片段與表
4、達(dá)載體pGEx一2T相連，獲得可用于原核表達(dá)的重組質(zhì)粒pGEX-S和pGEX一2S。3．重組蛋白的表達(dá)和純化：將重組質(zhì)粒pGEX-S和pGEX-2S轉(zhuǎn)化入表達(dá)型感受態(tài)細(xì)胞BL21中，并對菌株的表達(dá)條件進(jìn)行了摸索，發(fā)現(xiàn)0．8mmol／1的IPTG誘導(dǎo)4小時(shí)為最好。提取總蛋白進(jìn)行WesternBlot，發(fā)現(xiàn)S-GST的表達(dá)量明顯高于2S—GST。利用親和層析法純化重組蛋白S-GST，用于多克隆抗體的制各。4．?dāng)M蜘蛛牽絲蛋白基因單體(S)多克隆抗體的制備：取適量純化后S—GST重組蛋白與佐劑混合乳化，利用皮下多點(diǎn)注射的方法免疫8只CDI小白鼠，免疫結(jié)束后
5、經(jīng)ELISA檢測，發(fā)現(xiàn)其中的兩只小鼠的抗血清濃度較高，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。關(guān)鍵詞：牽絲蛋白基因；原核表達(dá)：多克隆抗體；ELISAProkaryoticExpressionandPreparationofAntibodyofSpiderDraglinelikegeneAbstractBecauseofspiderdragsilkhaveexcellentmechanicalpropertiesitcouldbeincreasinglyusedasmaterialinmedical、buildingandSOon．Butitishardtogetthena
6、turalspidersilk．Usingprokaryoticbioreactoriseffectivemethodtogetalargeofartificialspidersilk．WeconstructedprokaryoticexpressionplasmidspGEX-SandpGEX一2SwhichwereexpressedinBL21，therecombinantproteinfromthehigherexpressioncellwasusedasantigenandimmunizedmicetopreparinganti-serum
7、．Thoughthisresearchweexploredandestablishedsuitableprokaryoticexpressionsystemofrecombinantspidersilkproteinandprovidedmaterialforfollowingdetected．Theresultsaleasfotlows：1．Spiderdraglinesilkproteingenesynthesis：Wesynthesizedspiderdragtinesilkproteingenemonomerartificiallyacco
8、rdingtothepublishedeDNAfragmentsofNephilaclavataspider,thenco
