硒蛋白X基因克隆、定點突變、原核表達及多克隆抗體制備.pdf

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1、動物營養(yǎng)學(xué)報2015，27(5)：1485—1491ChineseJournalofAnimalNutritiondoi：10．3969／j．issn．1006-267x．2015．05．019硒蛋白X基因克隆、定點突變、原核表達及多克隆抗體制備趙華湯加勇曹蕾周繼昌賈剛劉光芒陳小玲王康寧(1．四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)研究所，成都611130；2．深圳市慢性病防治中心分子生物學(xué)實驗室，深圳518020)摘要：本試驗旨在克隆鑒定豬硒蛋白X(SelX)基因，將其定點突變后進行原核表達，獲得重組蛋白，并制備豬SelX多克隆抗體，為以豬為模型SelX功能研究

2、奠定基礎(chǔ)。利用cDNA末端快速克隆(3一RACE)技術(shù)從豬肝臟總RNA擴增出含開放閱讀框(ORF)至poly(A)共l2l5bp的SelX基因cDNA片段，其348bp的ORF編碼區(qū)和對應(yīng)的氨基酸殘基與人相應(yīng)序列分別有88％和9l％序列同源性，豬基因提交NCBIGenBank數(shù)據(jù)庫，序列號為EF113597。ORF編碼氨基酸殘基中硒代半胱氨酸(Sec)位于C一端第95個殘基，其編碼密碼子TGA經(jīng)定點突變?yōu)榘腚装彼?Cys)的TGT后，將其插入載體pET30，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中，在0．5mmol／L異丙基硫代-13-D-半乳糖苷(I

3、PTG)誘導(dǎo)2h獲得融合表達產(chǎn)物，經(jīng)His—tag親和層析后，獲得分子質(zhì)量為18．0ku的純化蛋白。將純化獲得的SelX基因突變體融合蛋白(SelXm)免疫兔子，得到效價高達l：20000的多克隆抗體，免疫印跡(Western—blot)結(jié)果顯示該抗體能特異性識別純化的SelXm和豬肝臟中相應(yīng)SelX。本試驗成功克隆并鑒定了豬SelX基因，并制備了其多克隆抗體。關(guān)鍵詞：豬基因；克??；定點突變；原核表達；多克隆抗體中圖分類號：$828文獻標識碼：A文章編號：1006—267X(2015)05—1485．07自從1973年Rotruck等發(fā)現(xiàn)硒是谷

4、胱甘肽過目前在人和鼠中已經(jīng)通過試驗探明了部分硒氧化物酶的組成部分以來，到目前為止人們已在蛋白的功能，但大部分硒蛋白生物學(xué)功能尚不清人類發(fā)現(xiàn)了25種硒蛋白，在嚙齒動物鼠中發(fā)現(xiàn)了楚，當中包括硒蛋白X(SelX)。研究發(fā)現(xiàn)SelX基24種硒蛋白J。硒蛋白是一類特殊蛋白質(zhì)，其硒因的mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物組織分布廣泛，尤其在肝臟、代半胱氨酸(selenocysteine，Sec)合成進入蛋白質(zhì)白細胞等中表達量較高J。豬與人類在生理結(jié)構(gòu)是由密碼子UGA介導(dǎo)的翻譯行為。在沒有特殊和功能上具有多方面的相似性，這些相似性使豬識別因子存在時，UGA是1個終止信號；而在有

5、特成為人類一些疾病的理想動物模型_6J，以豬為模殊識別因子時，該密碼子則指導(dǎo)Sec合成摻人到蛋型研究SelX生物學(xué)功能具有重要意義。在此本試白質(zhì)分子中，故Sec被認為是第21種氨基酸J。驗擬克隆豬SelX基因，并對其Sec密碼子進行定哺乳動物硒蛋白mRNA在其3，_非編碼區(qū)(3一點突變后，構(gòu)建原核表達載體，表達SeIX基因突變UTR)中都含有Sec插入序列(selenocysteineinser—體蛋白(SelXm)，制備豬SelXm多克隆抗體，為進tionsequence，SECIS)，其二級結(jié)構(gòu)為莖環(huán)結(jié)構(gòu)，在一步以豬為模型研究SelX生物學(xué)

6、功能奠定基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)合成時，它與SECIS結(jié)合蛋白2、特殊轉(zhuǎn)錄因子共同作用，識別編碼Sec的密碼子UGA3J。收稿日期：2014—11—30基金項目：國家自然科學(xué)基金面上項目(31072043，31272468)；四川農(nóng)業(yè)大學(xué)雙支計劃作者簡介：趙華(1974一)，男，四川雅安人，副研究員，博士，主要研究領(lǐng)域為營養(yǎng)與分子生物學(xué)。E．mail：zhua666@126．com動物營養(yǎng)學(xué)報Blast、SECISearch2．18等在線分析軟件對克隆的1材料與方法DNA序列進行序列分析，確認后提交NCBIGen—1．1試驗動物、菌株及質(zhì)粒Bank。健康成

7、年雄性家兔2只(體重2．0—2．5kg)，1．4SelX基因定點克隆、原核表達載體構(gòu)建購自四JII農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)農(nóng)場，克隆載體pMD18一T以克隆的SelX—pMD18一T質(zhì)粒為模版，在SelX購自寶生物工程(大連)有限公司，大腸桿菌基因的ORF內(nèi)Sec密碼子TGA附近設(shè)計突變引TOP10、原核表達載體pET30，大腸桿菌BL21物突變引物Mx—F：5一TCAGCAGTTCCCT—(DE3)等由本實驗室保存。GAAGTTCATC一3和MX—R：5一ATATACA—1．2主要試劑GAAGCGGGACTGTCC一3，應(yīng)用反向PCR技術(shù)，DNA限制性內(nèi)

8、切酶、AMV第l鏈cDNA合成利用突變引物對進行PCR擴增，對SelX基因?qū)崿F(xiàn)試劑盒、T4DNA連接酶、pfuTaqDNA聚合酶、定點突變，將密碼子由