小鼠foxp3蛋白的原核表達(dá)及多克隆抗體的制備

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1、小鼠Foxp3蛋白的原核表達(dá)及多克隆抗體的制備作者：鮑俊峰,王勝軍,馬潔,崔大偉，楊先知，毛朝明,仝佳,邵啟祥,許化溪【摘要】目的：體外原核表達(dá)小鼠Foxp3蛋白，并以其免疫家兔，制備多克隆抗體。方法：從質(zhì)粒Foxp3pMD18T擴(kuò)增小鼠Foxp3全長基因，亞克隆至原核表達(dá)載體pET32a，轉(zhuǎn)化E.coliBL21；IPTG誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，Ni2+NTA柱純化及蛋白質(zhì)印跡鑒定蛋白；純化蛋白免疫家兔，制備多克隆抗體，ELISA法檢測抗體效價，蛋白質(zhì)印跡檢測抗體特異性。結(jié)果：成功構(gòu)建了Foxp3pET32a原

2、核表達(dá)載體，表達(dá)和純化了目的蛋白；ELISA法檢測抗體效價為1∶20000，蛋白質(zhì)印跡檢測結(jié)果顯示抗體特異性與小鼠Foxp3蛋白結(jié)合。結(jié)論：成功表達(dá)小鼠Foxp3蛋白并制備了多克隆抗體?！娟P(guān)鍵詞】Foxp3；原核表達(dá)；多克隆抗體；小鼠　　［Abstract］Objective:TopreparerabbitpolyclonalantibodyagainstmouseFoxp3proteinbyprokaryoticexpressionofmouseFoxp3proteininvitro.Methods：Foxp3gene

3、wasamplifiedbyPCRfromthefulllengthplasmidFoxp3pMD18TandsubclonedintothepET32avector;therecombinantplasmid12wastransformedintoE.coliBL21andtheexpressionofrecombinantproteinwasinducedbyIPTG.afterpurifiedwithNi2+NTAcolumn,identificationoftherecombinantproteinby

4、Westernblotwasperformed;thepurifiedproteinwasusedasantigentoimmunizerabbits,thetiterandthespecificityoftherabbitantiFoxp3antibodyweredetectedbyELISAandWesternblot,respectively.Results：TheprokaryoticexpressionvectorforFoxp3pET32awasconstructedsuccessfully;mouse

5、Foxp3proteinhadbeenexpressedandpurified;rabbitpolyclonalantibodyagainstmouseFoxp3proteinwasprepared,thetiteroftheantibodywas1∶20000byELISAandWesternblotanalysisshowedthatthepolyclonalantibodycouldspecificallyrecognizemouseFoxp3protein.Conclusion：MouseFoxp3protein

6、hadbeenexpressedandrabbitantiFoxp3antibodyhadbeenpreparedsuccessfully.　?。跭eywords］Foxp3;prokaryoticexpression;polyclonalantibody;mouse　　FOX(forkheadbox)是脊椎動物叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子的總稱，是一個具有多種功能的轉(zhuǎn)錄因子家族，通常和細(xì)胞生長發(fā)育的調(diào)控有關(guān)［1］。Foxp3蛋白是叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子家族中的成員，122001年由Brunkow等［2］首次報道。小鼠Foxp3基因位于其X

7、染色體，全長為3739bp(包含5′端非編碼的外顯子)，其基因編碼的蛋白質(zhì)也稱為Scurfy，由429個氨基酸組成，N末端有鋅指蛋白、亮氨酸拉鏈和一個富含脯氨酸的區(qū)域，而叉頭樣DNA結(jié)合域與其他FOX成員不同,靠近蛋白C末端［3］。Foxp3在小鼠特異性表達(dá)于CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatoryTcells,Treg細(xì)胞)而不表達(dá)于CD8+T細(xì)胞，研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxp3作為Treg細(xì)胞發(fā)育的一個關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，它的表達(dá)及功能與Treg細(xì)胞密切相關(guān)［4］，可以更好地在分子水平上了解Treg細(xì)胞?！　”緦?shí)驗(yàn)室已經(jīng)

8、構(gòu)建小鼠Foxp3/AAV表達(dá)載體［5］，在此基礎(chǔ)上我們構(gòu)建原核表達(dá)載體Foxp3pET32a，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白，并進(jìn)行純化。利用純化的Foxp3蛋白免疫家兔，制備多克隆抗體，為研究小鼠Foxp3蛋白對Treg細(xì)胞的功能影響提供基礎(chǔ)?！　?材料與方法　　1.1材料　　1.1.1主要試劑ExTaqDNA聚合酶