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1、動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)2015，27(5)：1485—1491ChineseJournalofAnimalNutritiondoi：10．3969／j．issn．1006-267x．2015．05．019硒蛋白X基因克隆、定點(diǎn)突變、原核表達(dá)及多克隆抗體制備趙華湯加勇曹蕾周繼昌賈剛劉光芒陳小玲王康寧(1．四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所，成都611130；2．深圳市慢性病防治中心分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，深圳518020)摘要：本試驗(yàn)旨在克隆鑒定豬硒蛋白X(SelX)基因，將其定點(diǎn)突變后進(jìn)行原核表達(dá)，獲得重組蛋白，并制備豬SelX多克隆抗體，為以豬為模型SelX功能研究
2、奠定基礎(chǔ)。利用cDNA末端快速克隆(3一RACE)技術(shù)從豬肝臟總RNA擴(kuò)增出含開(kāi)放閱讀框(ORF)至poly(A)共l2l5bp的SelX基因cDNA片段，其348bp的ORF編碼區(qū)和對(duì)應(yīng)的氨基酸殘基與人相應(yīng)序列分別有88％和9l％序列同源性，豬基因提交NCBIGenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，序列號(hào)為EF113597。ORF編碼氨基酸殘基中硒代半胱氨酸(Sec)位于C一端第95個(gè)殘基，其編碼密碼子TGA經(jīng)定點(diǎn)突變?yōu)榘腚装彼?Cys)的TGT后，將其插入載體pET30，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中，在0．5mmol／L異丙基硫代-13-D-半乳糖苷(I
3、PTG)誘導(dǎo)2h獲得融合表達(dá)產(chǎn)物，經(jīng)His—tag親和層析后，獲得分子質(zhì)量為18．0ku的純化蛋白。將純化獲得的SelX基因突變體融合蛋白(SelXm)免疫兔子，得到效價(jià)高達(dá)l：20000的多克隆抗體，免疫印跡(Western—blot)結(jié)果顯示該抗體能特異性識(shí)別純化的SelXm和豬肝臟中相應(yīng)SelX。本試驗(yàn)成功克隆并鑒定了豬SelX基因，并制備了其多克隆抗體。關(guān)鍵詞：豬基因；克??；定點(diǎn)突變；原核表達(dá)；多克隆抗體中圖分類號(hào)：$828文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1006—267X(2015)05—1485．07自從1973年Rotruck等發(fā)現(xiàn)硒是谷
4、胱甘肽過(guò)目前在人和鼠中已經(jīng)通過(guò)試驗(yàn)探明了部分硒氧化物酶的組成部分以來(lái)，到目前為止人們已在蛋白的功能，但大部分硒蛋白生物學(xué)功能尚不清人類發(fā)現(xiàn)了25種硒蛋白，在嚙齒動(dòng)物鼠中發(fā)現(xiàn)了楚，當(dāng)中包括硒蛋白X(SelX)。研究發(fā)現(xiàn)SelX基24種硒蛋白J。硒蛋白是一類特殊蛋白質(zhì)，其硒因的mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物組織分布廣泛，尤其在肝臟、代半胱氨酸(selenocysteine，Sec)合成進(jìn)入蛋白質(zhì)白細(xì)胞等中表達(dá)量較高J。豬與人類在生理結(jié)構(gòu)是由密碼子UGA介導(dǎo)的翻譯行為。在沒(méi)有特殊和功能上具有多方面的相似性，這些相似性使豬識(shí)別因子存在時(shí)，UGA是1個(gè)終止信號(hào)；而在有
5、特成為人類一些疾病的理想動(dòng)物模型_6J，以豬為模殊識(shí)別因子時(shí)，該密碼子則指導(dǎo)Sec合成摻人到蛋型研究SelX生物學(xué)功能具有重要意義。在此本試白質(zhì)分子中，故Sec被認(rèn)為是第21種氨基酸J。驗(yàn)擬克隆豬SelX基因，并對(duì)其Sec密碼子進(jìn)行定哺乳動(dòng)物硒蛋白mRNA在其3，_非編碼區(qū)(3一點(diǎn)突變后，構(gòu)建原核表達(dá)載體，表達(dá)SeIX基因突變UTR)中都含有Sec插入序列(selenocysteineinser—體蛋白(SelXm)，制備豬SelXm多克隆抗體，為進(jìn)tionsequence，SECIS)，其二級(jí)結(jié)構(gòu)為莖環(huán)結(jié)構(gòu)，在一步以豬為模型研究SelX生物學(xué)
6、功能奠定基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)合成時(shí)，它與SECIS結(jié)合蛋白2、特殊轉(zhuǎn)錄因子共同作用，識(shí)別編碼Sec的密碼子UGA3J。收稿日期：2014—11—30基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(31072043，31272468)；四川農(nóng)業(yè)大學(xué)雙支計(jì)劃作者簡(jiǎn)介：趙華(1974一)，男，四川雅安人，副研究員，博士，主要研究領(lǐng)域?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)與分子生物學(xué)。E．mail：zhua666@126．com動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)Blast、SECISearch2．18等在線分析軟件對(duì)克隆的1材料與方法DNA序列進(jìn)行序列分析，確認(rèn)后提交NCBIGen—1．1試驗(yàn)動(dòng)物、菌株及質(zhì)粒Bank。健康成
7、年雄性家兔2只(體重2．0—2．5kg)，1．4SelX基因定點(diǎn)克隆、原核表達(dá)載體構(gòu)建購(gòu)自四JII農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)農(nóng)場(chǎng)，克隆載體pMD18一T以克隆的SelX—pMD18一T質(zhì)粒為模版，在SelX購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，大腸桿菌基因的ORF內(nèi)Sec密碼子TGA附近設(shè)計(jì)突變引TOP10、原核表達(dá)載體pET30，大腸桿菌BL21物突變引物Mx—F：5一TCAGCAGTTCCCT—(DE3)等由本實(shí)驗(yàn)室保存。GAAGTTCATC一3和MX—R：5一ATATACA—1．2主要試劑GAAGCGGGACTGTCC一3，應(yīng)用反向PCR技術(shù)，DNA限制性內(nèi)
8、切酶、AMV第l鏈cDNA合成利用突變引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)SelX基因?qū)崿F(xiàn)試劑盒、T4DNA連接酶、pfuTaqDNA聚合酶、定點(diǎn)突變，將密碼子由
