膠原蛋白肽生物功能材料的研究與開發(fā)

《膠原蛋白肽生物功能材料的研究與開發(fā)》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。

1、摘要近年來隨著生物醫(yī)學(xué)與生物技術(shù)的突破性研究發(fā)展，發(fā)現(xiàn)了膠原蛋白肽在人體內(nèi)有重要作用，其中，最具里程碑意義的是發(fā)現(xiàn)膠原蛋白肽有著自己的特征和性能。本論文將復(fù)合酶降解的膠原蛋白肽為研究方向，試圖建立一套系統(tǒng)的研究方案：對膠原蛋白肽的復(fù)合酶提取工藝、分離純化、檢測技術(shù)以及相關(guān)理論進(jìn)行探討；并對氨基酸序列和三維立體結(jié)構(gòu)特點(diǎn)以及膠原蛋白肽的一些功能和性質(zhì)進(jìn)行分析和研究；同時(shí)，對金屬肽的合成和膠原蛋白肽的應(yīng)用進(jìn)行了初步探索。用復(fù)合酶去酶解皮革下腳料鉻革屑，利用酸性蛋白酶3350、堿性蛋白酶2709、中性蛋白酶ASl．398、Prot硼ex、FlavourzyTne等水解皮革，提取

2、其中的膠原蛋白肽。選擇和影響酶作用的各種影響因素表明：先用Ca0進(jìn)行前處理，再用堿性蛋白酶2709和中性蛋白酶Asl．398的協(xié)同作用進(jìn)行酶解，將水解液進(jìn)行過濾后，脫鉻并濃縮干燥是一條有效的工藝途徑。產(chǎn)物的檢驗(yàn)結(jié)果證實(shí)：粗蛋白含量≥90％。研究還提出了用阿貝折射儀測定溶液折射率來控制水解程度，并從原理上對其可行性進(jìn)行了論證，試驗(yàn)結(jié)果給予了證實(shí)。用上述產(chǎn)物——水解膠原蛋白肽作為合成肽銅的原料，研究得到的工藝條件為：反應(yīng)液pH=ll，常溫反應(yīng)20min：紅外光譜法鑒定了目標(biāo)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的正確性；x一衍射和核磁技術(shù)對金屬肽進(jìn)行了測定，并表征了其三維空間結(jié)構(gòu)。設(shè)計(jì)了毛細(xì)管層析質(zhì)譜法

3、結(jié)合等電點(diǎn)聚焦法以及數(shù)據(jù)庫搜尋蛋白質(zhì)組的聯(lián)機(jī)設(shè)備，即多維分離鑒定技術(shù)，使得研究工作簡單易行。設(shè)備所使用的樣品及緩沖溶液用量可微型化，樣品量減少到loo斗L以下，緩沖液的用量僅為5～10IllL，此項(xiàng)技術(shù)更有利于生化樣品快速準(zhǔn)確的檢測。對分離純化后的膠原蛋白肽進(jìn)行了序列測定和空間立體結(jié)構(gòu)的表征。用現(xiàn)代分析手段對膠原蛋白肽三維立體圖譜、片斷圖譜和氨基酸組成以及結(jié)構(gòu)等進(jìn)行了測定和研究。直觀地觀察了氨基酸的傾向結(jié)構(gòu)和底部結(jié)構(gòu)、卡通環(huán)和主骨架、二級結(jié)構(gòu)和末端、金屬化合物的配體結(jié)構(gòu)、膠原肽的晶體結(jié)構(gòu)、水合結(jié)構(gòu)以及多聚體結(jié)構(gòu)等。對膠原蛋白肷的功能和性質(zhì)進(jìn)行了研究和討論。在膠原蛋白膚中

4、引入硫酵基，使二硫鍵控制溶解肽在DBC中的活動(dòng)成為可能。DBc一溶解肽共軛體證實(shí)了溶解肽的活性：其在制備后至少3個(gè)月內(nèi)穩(wěn)定；受pH值變化的影響，其活性在熱處理后比自由酶穩(wěn)定；pH=6．3時(shí)，活性最強(qiáng)，麗天然溶解肽的pH=9。0。西北工業(yè)是學(xué)博士擘位論文研究發(fā)現(xiàn)，膠原蛋白肽濃度大于0．5Illg·mL“時(shí)，在465咖處的熒光強(qiáng)度有突躍：繼續(xù)增大濃度，熒光強(qiáng)度越來越大。當(dāng)膠原蛋白肽濃度增大并超過0．15mg·IllL。時(shí)，體系具有較高的粘度，進(jìn)一步證實(shí)了膠原蛋白肽在水溶液中的聚集特性。采用高效液相色譜法，優(yōu)化流動(dòng)相的組成，成功地將16種目標(biāo)肽與其它雜質(zhì)分離。同時(shí)成功地分析了

5、結(jié)構(gòu)相似的小分子肽。以三氟乙酸為流動(dòng)相和酸性調(diào)節(jié)劑，考察乙腈一水不同配比對肽分離的影響，流動(dòng)相乙腈含量在20％和流速在1．OlllL·min～，可達(dá)到分麓的目的。目標(biāo)肽純度范圍23．78％～89．9096，保留時(shí)聞3．35～27．15min。胰島素^鏈和胰島素B鏈標(biāo)準(zhǔn)品測定結(jié)果為：主峰純度分別為79．98％和87．69％，而產(chǎn)品的標(biāo)示純度為80．1I％和89．34％，這表明本方法的分離效率較好。建立了一種有效分離小分：F肽的Tricine—SD爭PAGE的方法。調(diào)整膠中聚丙烯酰胺膠的組成，讓致密膠中丙烯酰胺和雙丙烯酰胺的交聯(lián)度為5．5％，并加入38％的尿素，可以有效地分

6、離≤lkD的馭鏈，此方法明顯優(yōu)于常規(guī)的sDS—PAGE和現(xiàn)有的Tricine—SDS～PAGE方法。毛細(xì)管電泳一十二烷基硫酸鈉(cE_SDs)蛋白設(shè)備用于亞膠原蛋白肽的動(dòng)力學(xué)篩選分離。最佳條件為：使用36cm(或24cm)×50um的無涂層毛細(xì)管，電泳注射電壓為10后∥10s，操作電壓15膏虬毛細(xì)管溫度20℃。在220舢處紫外檢測，發(fā)現(xiàn)此方法有很好的重現(xiàn)性，且實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均呈線性關(guān)系。膠原蛋白肽的動(dòng)力學(xué)篩選毛細(xì)管電泳(DscE)圖在數(shù)值上、相關(guān)含量上與用庫馬西著色的SDS—PAGE凝膠掃描結(jié)果相似。本項(xiàng)目的產(chǎn)品經(jīng)分析檢測，富含19種氨基酸，蛋白質(zhì)含量超過90％。應(yīng)用研究表明

7、：酶解提取的分子量為3000～4000Da的膠原蛋白肽，對皮膚和毛發(fā)有明顯的保濕、抗氧化、增加彈性和緊實(shí)性的作用。關(guān)鍵詞：復(fù)合酶；膠原蛋白肽；分離純化；序列：空間立體結(jié)構(gòu)；金屬肽。ⅡABSTRACTIIlrec％tyears，獅inlpommtresea玎ch丘eldh鷦beefldiscova司tlI砒conag吼pepddch越a孵ate依斌onhum齟body，paniculady’h硒characte瑁alldfilnc曲瑚whichcanbeaplpIiodiIIt0bi咖edical鋤dbi疵hnolo百cal6eld．hlt