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《新型篩選標記的煙草葉綠體轉化載體構建》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內(nèi)容在學術論文-天天文庫。
1、安徽農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文新型篩選標記的煙草葉綠體轉化載體構建姓名：洪登華申請學位級別：碩士專業(yè)：生物物理學指導教師：范軍20080601摘要葉綠體基因組轉化的篩選標記多為抗生素抗性基因，它們雖然高效，但存在不少缺點。四吡咯分子如血紅素、葉綠素和西羅血紅素是植物重要的功能分子，其合成一些關鍵酶的編碼基因，如編碼谷氨酸半醛轉氨酶的基因作為植物轉基因的安全標記，根據(jù)轉基因后代的白化性狀，進行高效篩選，而尿卟啉原甲基化酶是一種新型紅色熒光蛋白，但是，在植物中的應用還沒有報道。目前，煙草質體轉化的技術最為成熟，本研究主要構建煙草葉綠體轉化載體，將大腸桿菌編碼谷氨酸半醛轉氨酶的基因hemL作
2、為篩選標記，玉米編碼尿卟啉原甲基化酶的基因cobA作為熒光報告基因，利用同源重組片段trnI／trnA構建煙草葉綠體遺傳轉化的表達載體。本實驗結果如下：1．采用改進的高鹽低pH法提取煙草葉綠體基因組DNA，基因組大小為23kb，OD260：OD280值均在1．8~2．0范圍內(nèi)，提取的葉綠體基因組質量很高。2．根據(jù)NCBI公布的煙草同源重組蛋白trnI／trnA、質體核搪體(16S)RNA操縱元啟動子腑z和質體psbA基因3’端psbA3序列，以煙草葉綠體基因組為模板，PCR擴增出trnI／trnA、脅z、psbA3’的特異DNA片段，擴增片段測序結果：trnl基因長度為969bp
3、，trnA基因長度為883bp，P，仰基因長度為144bp，psbA3，基因長度為508bp，與煙草葉綠體基因組公布的序列進行對比分析，同源性較高。3．根據(jù)公布的hemL和cobA序列，分別以大腸桿菌谷氨酸半醛轉氨酶基因GSAT的重組質粒和玉米尿卟啉原甲基化酶SUMT的重組質粒為模板，PCR擴增出hemL和cobA特異片段。擴增片段測序結果：hemL基因長度為1288bp，cobA基因長度為846bp。與公布的序列進行對比分析，同源性為100％。4．分別用相應的限制性內(nèi)切酶消化相應的重組質粒，回收外源片段，根據(jù)pBluescriptSK+多克隆位點和順序，按差異性位點將外源片斷依
4、次插入到pBluescriptSK+中，構建了煙草新型葉綠體表達載體pBSK—TPTCPhemL，序列為：棚h脅z_R&孓_÷JIlP，比一R8．譬_∞枷_易，柏3’一f門叫。用Hin铘酶切pBSK-TPTCPhemL載體，瓊脂糖凝膠電泳檢測大小為7000bp左右，說明構建的載體大小正確。綜上所述，本文成功克隆了編碼煙草葉綠體表達載體的基因片段，并構建了煙草表達載體，為進一步研究這兩個基因作為葉綠體轉化的篩選基因和標記基因、建立安全高效的葉綠體轉化體系和生物反應器技術奠定基礎，在作物遺傳育種改良方面具有廣闊的應用前景。關鍵詞：葉綠體轉化載體構建四吡咯分子合成煙草AbstractS
5、everalgenesencodingtheenzymesthatdecomposetheantibioticsareapplied嬲theselectingmarkersofchloroplasttransformation．Theydisplayefficientinthescreenoftransienceplants，However,thesegeneshavesevsraldisadvantages．Non—antibioticgeneshavebeenappliedinrecentyears．Amongthem，somegenesencodetheenzymesinv
6、olvedinthebiosynthesisofplanttetrapyrrolesincludinghemes，chlorophyllsandsiroheme，whichareimportantforplantgrowth．Thegeneencodingglutamatesemialdehydeaminotransferaseisusedasthehighefficientscreenmarkersincetheoffspringsplantwithoutthemarkerproducealbinoseedlings．Uroporphyrinogenmethyltransfer
7、aseisanovelredfluorescentindicatorsinbacteria，fungiandmammaliancells，butitsapplicationinplantsisneededtofurtherstudy．Tobaccoiswidelyusedasthemodelforchloroplasttransformationduetohighefficiency．Inthisstudy,weconstructedthechloroplasttransform
