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1、鄭州大學(xué)碩士學(xué)位論文杜氏鹽藻CCAP19/18葉綠體轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化姓名：張匯征申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：免疫學(xué)指導(dǎo)教師：潘衛(wèi)東201204摘要杜氏鹽藻CCAPl9／18葉綠體轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化近年來，藻類作為一種新的生物反應(yīng)器得到重視，相對于已有的大腸桿菌、酵母、轉(zhuǎn)基因動植物系統(tǒng)而言，具有生長迅速、培養(yǎng)簡單、易于遺傳操作、成本低廉等特點(diǎn)，受到了人們的青睞。其中鹽藻是迄今已知最耐鹽的單細(xì)胞真核綠藻，可在0．05．5．5MNacl中生長，是適合大規(guī)模開放式培養(yǎng)的理想微藻。目前，模式生物衣藻的轉(zhuǎn)基因研究已趨于成熟，作為衣藻的近緣藻，鹽藻的轉(zhuǎn)基因研究也在逐
2、步進(jìn)展，已有多種蛋白在鹽藻核系統(tǒng)中表達(dá)。隨著核轉(zhuǎn)化系統(tǒng)研究不斷深入，也發(fā)現(xiàn)了一些至今尚未解決的難題：表達(dá)量低、基因組大且背景復(fù)雜、外源基因轉(zhuǎn)入后易出現(xiàn)失活、沉默和位置效應(yīng)、在其內(nèi)表達(dá)原核基因必先經(jīng)修飾改造、環(huán)境安全問題等易發(fā)生，葉綠體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)因其定點(diǎn)整合，可人為控制其插入位點(diǎn)，從而很好地解決了核轉(zhuǎn)化后“基因失活”、“位置效應(yīng)”等問題。而葉綠體DNA分子的多拷貝及多順反子的表達(dá)形式，可使外源基因由共同的啟動子控制，不僅操作簡便而且避免了“共沉默”現(xiàn)象，還對外源性表達(dá)產(chǎn)物的積累擁有較高的耐受能力，為外源基因的在其系統(tǒng)的高效表達(dá)提供了保障。其母系遺傳的特點(diǎn)也使
3、其具有較高的生物安全性，因此葉綠體轉(zhuǎn)化成為鹽藻轉(zhuǎn)化的一個(gè)重要方向。葉綠體轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵是構(gòu)建能夠定點(diǎn)整合的表達(dá)載體，必須有適宜的同源序列和插入位點(diǎn)。杜氏鹽藻CCAPl9／18的葉綠體基因全序列已測定完畢(Genbank號：GQ250046．1，全長269044bp)，為建立鹽藻的葉綠體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)提供了極大的便利。本文選取chiN基因作為同源片段，將外源基因插入其內(nèi)。ehlN基因與chlB、chlL一起編碼光非依賴的原葉綠素酸酯還原酶，任一破壞均可阻斷葉綠素在黑暗條件的合成，但藻類可通過光依賴的原葉綠素酸酯還原酶合成葉綠素，不影響其生存。通過密度梯度離心法分離杜
4、氏鹽藻完整葉綠體，提取葉綠體DNA，作為模板，設(shè)計(jì)引物采用PCR法擴(kuò)增獲得了chlN目的片段1622bp。以chiN基因片段摘要為同源片段，以aptA基因的啟動子和rbcL基因的終止子為調(diào)控元件，以氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(cat)為篩選標(biāo)記，構(gòu)建了杜氏鹽藻葉綠體表達(dá)載體pchlNl622．CAT，在25心、0．8kV條件下通過電擊法轉(zhuǎn)入野生型杜氏鹽藻中。為實(shí)現(xiàn)葉綠體的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，必須有適宜的選擇壓力，有效地殺死未轉(zhuǎn)入外源基因和未有效整合的藻株，并使轉(zhuǎn)入整合的外源基因順利地實(shí)現(xiàn)同質(zhì)化。本實(shí)驗(yàn)針對杜氏鹽藻CCAPl9／18，對各類常用抗生素的敏感性進(jìn)行了篩選，并
5、對其敏感的氯霉素進(jìn)行了粗篩和細(xì)選，最終確定CCAPl9／18葉綠體轉(zhuǎn)化的氯霉素選擇濃度為300}tg／ml。結(jié)果表明：通過電擊法將載體pUC．chlNl622．CAT轉(zhuǎn)入CCAPl9／18葉綠體中，在300肛g／ml的選擇壓力下，野生藻在7．8天死亡，而轉(zhuǎn)化藻則繼續(xù)生長，PCR擴(kuò)增鑒定表明CAT基因已整合入CCAPl9／18葉綠體基因組中。關(guān)鍵詞：杜氏鹽藻CCAPl9／18葉綠體轉(zhuǎn)化catIIAbstractConstructionoftransformationvectorpchlN-．CAT-BARforchloroplastofDunaliella
6、salinaIIltherecentyears．a(chǎn)sanewkindoftransgenicbioreactor，themicroalgaehavereceivedconsiderableattentionandbeengettingmorefavorjustbecausetheiradventagessuchasfewergrowthtime,lowercostofproductionandbeingeasierfortransgcnicmanipulationcomparedtootherexpressionsystemssuchasescheric
7、hiacoli，yeast，transgenicanimalsandplants．Dunaliellasalinaisaunicellular,halophilicgreenalgabelongingtoheClorophyceae，andamongthemostimportantlysalttolerantmicroalgae．Itcansurvivein0．05．5．5MNaCl，andissuitableforlarge—scaleopenculture．Presently，theresearchontransgenicmodelorganisms
8、suchasChlamydomonashasalreadybecomemorea
