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《鈍頂螺旋藻表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化研究》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文鈍頂螺旋藻表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化研究姓名：王芬申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：微生物學(xué)指導(dǎo)教師：唐欣昀20080601摘要本文研究螺旋藻對刀豆氨酸(CS)和不同抗生素的耐受性和敏感性；提取螺旋藻抗CS突變株A9c的基因組DNA轉(zhuǎn)化野生藻株A9，獲得同源轉(zhuǎn)化螺旋藻的參數(shù)組合；構(gòu)建含有螺旋藻A9啟動(dòng)子的外源質(zhì)粒載體p215t．spp，并將其轉(zhuǎn)入螺旋藻A9，實(shí)現(xiàn)綠色熒光蛋白GFP在螺旋藻細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定表達(dá)。本研究初步建立了一套螺旋藻遺傳轉(zhuǎn)化操作系統(tǒng)，可為螺旋藻轉(zhuǎn)基因操作提供重要技術(shù)參考。Chl、Str對螺旋藻均有很強(qiáng)的抑制作用，在液體培養(yǎng)條件下，1．0
2、嶺-ml卅的Chl、31xg·ml“的Str對螺旋藻有完全的致死作用；固體培養(yǎng)條件下，1．299·ml。的Chl、499·mlq的Str可完全抑制螺旋藻在固體平板上的生長。Amp對螺旋藻有較強(qiáng)抑制作用，液體培養(yǎng)時(shí)Amp對螺旋藻的MIC為100txg·ml～；固體培養(yǎng)時(shí)Amp對螺旋藻的MIC約為200}tg·ml～。螺旋藻對Km很不敏感，在60099tml_Km的液體培養(yǎng)基中，螺旋藻的生長完全不受抑制。Chl、Str和Amp均適合作為螺旋藻的抗性篩選標(biāo)記，篩選濃度分別為：1．299‘ml一、4txg’ml～、200}tg’ml～。將螺旋藻抗CS突變株A9c的基
3、因組DNA作為材料轉(zhuǎn)化野生藻株A9，以30}tg·ml‘1的CS作為篩選壓力，獲得了轉(zhuǎn)化藻株，得到了一些同源轉(zhuǎn)化的參數(shù)：在低于最適生長溫度的條件下(24℃)培養(yǎng)螺旋藻；轉(zhuǎn)化前用2mmol·L。的EDTA預(yù)處理24h；利用超聲波對螺旋藻進(jìn)行處理，功率為300w，處理時(shí)間為70s；采用自然轉(zhuǎn)化方法，冰浴處理，避光條件下液體培養(yǎng)后涂平板，篩選轉(zhuǎn)化子。本實(shí)驗(yàn)以構(gòu)建的攜帶gyp基因的質(zhì)粒p215t．spp和出發(fā)質(zhì)粒p215t作為載體，分別采用冰浴法和PEG融合法轉(zhuǎn)化螺旋藻A9藻株，成功實(shí)現(xiàn)了gyp基因在螺旋藻株中的表達(dá)。比較了用不同質(zhì)粒在相同條件下轉(zhuǎn)化A9藻株的轉(zhuǎn)化率
4、，數(shù)據(jù)顯示p215t．spp可以比p215t極顯著提高轉(zhuǎn)化率(cc=0．01)，初步證明采用螺旋藻的啟動(dòng)子構(gòu)建質(zhì)?？梢蕴岣咿D(zhuǎn)化效果；比較了相同質(zhì)粒用不同方法轉(zhuǎn)化A9藻株的轉(zhuǎn)化率，數(shù)據(jù)顯示采用適當(dāng)濃度的PEG可以有效的提高轉(zhuǎn)化率。經(jīng)過反復(fù)實(shí)驗(yàn)證明，采用1％的PEG濃度作用30min可以獲得較高轉(zhuǎn)化率(10．5‰)。對轉(zhuǎn)化藻株進(jìn)行熒光檢測，藻絲段在390nm藍(lán)光激發(fā)下發(fā)出綠色熒光，證實(shí)gYp基因在轉(zhuǎn)化藻株中得到有效表達(dá)。連續(xù)觀察轉(zhuǎn)化藻株熒光發(fā)光情況發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化藻株轉(zhuǎn)接3次后均可觀察到綠色熒光，證明了咖基因成功實(shí)現(xiàn)了在螺旋藻細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定表達(dá)。關(guān)鍵詞：螺旋藻載體構(gòu)建g
5、yp基因PEG法轉(zhuǎn)化率綠色熒光AbstractInthispaper，thetoleranceandsensitivitiesofSpirulinatodifferentantibioticsandL--canavaninesulphate(CS)wasexpounded．Intheexperiment，weextractedDNAanti-CSmutantA9candtransformeditintoA9strain，thenweacceptedsomeparameterstotransformSpirulina．Also，weconstructedthe
6、foreignvectorp215t—sppwhichcontainsSpirulinapromoterA9，andtransformeditintoSpirulinapromoterA9．Thus，GreenFluorescentProtein(GFP)expressedsuccessfullyandstablyinSpirulina．ThisresearchestablishedasystemforgenetictransformationoperationofSpirulina，andprovidedimportantreferencetotrans—
7、genetechnologyofSpirulina．SpirulinawasextremelysensitivetoantibioticssuchasChlandStr．ThelethalconcentrationofChlandStrwere1．Olxg‘ml～and31xg。ml。1inliquidcultivatingand1．21xg‘ml～and4p,g‘ml?！甶nsolidcultivatingrespectively．TheSpirulinawasrelativelysensitivetoAmp．Theminimuminhibitorycon
8、centration(MIC)ofAmpwaslOO
