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《鈍頂螺旋藻luxab表達載體的構(gòu)建及電擊轉(zhuǎn)化研究》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文鈍頂螺旋藻luxAB表達載體的構(gòu)建及電擊轉(zhuǎn)化研究姓名：朱一偉申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：微生物學(xué)指導(dǎo)教師：唐欣昀20090601摘要本實驗以建立和完善螺旋藻的遺傳轉(zhuǎn)化操作系統(tǒng)為目標(biāo)，研究螺旋藻在液體和固體培養(yǎng)條件下對Amp(氨芐青霉素)的敏感度，確定篩選壓力Amp的濃度；克隆報告基因luxAB片段，與含有Ubil啟動子基因及amp基因的載體大片段連接重組，構(gòu)建新的穿梭質(zhì)粒載體：并對螺旋藻受體細(xì)胞進行預(yù)處理，抑制核酸酶活性，采用電擊轉(zhuǎn)化法將構(gòu)建的新質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化螺旋藻細(xì)胞．Amp對鈍頂螺旋藻A9藻株有較強抑制作用，液體培養(yǎng)時Amp對螺旋藻的最低抑
2、制濃度為1001．tg·ml"1：固體培養(yǎng)時Amp對螺旋藻的最低抑制濃度約為20099·如f1。Amp適合作為螺旋藻的抗性篩選壓力，篩選壓力為200I_tg·ml～。本實驗選擇合適載體質(zhì)粒pUCnGUS，使用EcoRI和SmaI雙酶切載體質(zhì)粒pUCnGUS獲得目的載體大片段(含有Ubil啟動子基因及amp抗性基因)，瓊脂糖凝膠電泳回收目的載體大片段；根據(jù)質(zhì)粒pRLl063a中l(wèi)ur．4B基因的堿基序列設(shè)計引物，在引物上下游分別加入EcoRI酶切位點和砌講酶切位點，以線型質(zhì)粒pRLl063a為DNA模板(Sail酶切)，采用PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))體外擴增目的標(biāo)記
3、基因片段lur．4B，瓊脂糖凝膠電泳純化PCR產(chǎn)物，雙酶切(EcoRI和Smal)PCR產(chǎn)物，利用凝膠回收試劑盒回收標(biāo)記基因片段luxAB；在T4DNA連接酶的作用下將載體大片段和luxAB基因片段進行體外連接重組，構(gòu)建帶有l(wèi)uxAB報告基因的新型穿梭質(zhì)粒載體pUCD．／uxAB；用氯化鈣法制備大腸桿菌MC4100A感受態(tài)細(xì)胞，采用熱激法將重組的穿梭質(zhì)粒載體pUCOduxAB轉(zhuǎn)化宿主E．coliMC4100A細(xì)胞，培養(yǎng)宿主細(xì)胞，胞內(nèi)擴增重組的質(zhì)粒載體pUCDduxAB；酶切鑒定重組質(zhì)粒；重組的質(zhì)粒載體pUCD．／uxAB轉(zhuǎn)化表達宿主細(xì)胞，加反應(yīng)底物癸醛觀察表達結(jié)
4、果。本實驗成功獲得含有Ubil啟動子基因及amp基因的載體大片段，有效地體外擴增目的標(biāo)記基因片段luxAB，成功將載體大片段和，z訓(xùn)B基因片段進行體外連接重組，酶切鑒定初步證明重組的穿梭質(zhì)粒載體pUCOJuxAB構(gòu)建成功。在低于最適生長溫度的條件-F(24℃)培養(yǎng)螺旋藻A9藻絲體；用2retool·L．1的EDTA預(yù)處理、培養(yǎng)24hs利用超聲波對螺旋藻A9藻絲體進行處理，功率為300W，處理時間為70st采用電擊轉(zhuǎn)化方法，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化螺旋藻A9細(xì)胞。本實驗電擊轉(zhuǎn)化螺旋藻細(xì)胞的脈沖時間為5．0ms、電場強度為4kv·cm"1；電擊緩沖液為無菌的含0．5mol·L
5、-1蔗糖(滲透壓穩(wěn)定劑)的1．0rnmol·L．1HEPES(pH7．5)3電擊轉(zhuǎn)化的對象為對數(shù)生長期中期的螺旋藻細(xì)胞。關(guān)鍵詞：螺旋藻載體構(gòu)建luxAB基因AbstractTheaimofthisexperimentistosetupandtoperfectthegeneticsystemofSpirulina．WestudiedtheextentthattheSpirulinaA9strainissensitivetoAmp，andclonedtheluxABgenefragmentandgotthevectorfragment麗ⅡlpromoterUbila
6、ndampgene．Wththetwofragments，weconstructedthenewplasmidvector．TheaimofthepretreatmentofSpirulinacellsistorestraintheactivityofnuclease，andthentheelectropomtionwasusedtotransformatetheSpirulinacells．111eSpirulinaA9strainisrelativelysensitivetoAmp．朋1elninilnuminhibitoryconcentration(MI
7、C)ofAmpis100肛g。ml—inliquidsituationand200pg·ml。1insolidsituationAmpmightbesuitableselectiongeneticmarkersfortheSpirulina，andtheselectionconcentrationsisdesignedas200pg·rni一．Inthisexperiment,theplasmidpUCf2GUSWasdigestedbytherestrictionenzymeSmalandEcoRI,andthevectorfragmentwithpromot
8、erUbilandamp
