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《杜氏鹽藻ccap1918葉綠體轉化載體的構建及轉化》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內容在學術論文-天天文庫。
1、鄭州大學碩士學位論文杜氏鹽藻CCAP19/18葉綠體轉化載體的構建及轉化姓名：張匯征申請學位級別：碩士專業(yè)：免疫學指導教師：潘衛(wèi)東201204摘要杜氏鹽藻CCAPl9／18葉綠體轉化載體的構建及轉化近年來，藻類作為一種新的生物反應器得到重視，相對于已有的大腸桿菌、酵母、轉基因動植物系統(tǒng)而言，具有生長迅速、培養(yǎng)簡單、易于遺傳操作、成本低廉等特點，受到了人們的青睞。其中鹽藻是迄今已知最耐鹽的單細胞真核綠藻，可在0．05．5．5MNacl中生長，是適合大規(guī)模開放式培養(yǎng)的理想微藻。目前，模式生物衣藻的轉基因研究已趨于成熟，作為衣藻的近緣藻，鹽藻的轉基因研究也在逐
2、步進展，已有多種蛋白在鹽藻核系統(tǒng)中表達。隨著核轉化系統(tǒng)研究不斷深入，也發(fā)現(xiàn)了一些至今尚未解決的難題：表達量低、基因組大且背景復雜、外源基因轉入后易出現(xiàn)失活、沉默和位置效應、在其內表達原核基因必先經(jīng)修飾改造、環(huán)境安全問題等易發(fā)生，葉綠體轉化系統(tǒng)因其定點整合，可人為控制其插入位點，從而很好地解決了核轉化后“基因失活”、“位置效應”等問題。而葉綠體DNA分子的多拷貝及多順反子的表達形式，可使外源基因由共同的啟動子控制，不僅操作簡便而且避免了“共沉默”現(xiàn)象，還對外源性表達產(chǎn)物的積累擁有較高的耐受能力，為外源基因的在其系統(tǒng)的高效表達提供了保障。其母系遺傳的特點也使
3、其具有較高的生物安全性，因此葉綠體轉化成為鹽藻轉化的一個重要方向。葉綠體轉化的關鍵是構建能夠定點整合的表達載體，必須有適宜的同源序列和插入位點。杜氏鹽藻CCAPl9／18的葉綠體基因全序列已測定完畢(Genbank號：GQ250046．1，全長269044bp)，為建立鹽藻的葉綠體轉化系統(tǒng)提供了極大的便利。本文選取chiN基因作為同源片段，將外源基因插入其內。ehlN基因與chlB、chlL一起編碼光非依賴的原葉綠素酸酯還原酶，任一破壞均可阻斷葉綠素在黑暗條件的合成，但藻類可通過光依賴的原葉綠素酸酯還原酶合成葉綠素，不影響其生存。通過密度梯度離心法分離杜
4、氏鹽藻完整葉綠體，提取葉綠體DNA，作為模板，設計引物采用PCR法擴增獲得了chlN目的片段1622bp。以chiN基因片段摘要為同源片段，以aptA基因的啟動子和rbcL基因的終止子為調控元件，以氯霉素乙酰轉移酶基因(cat)為篩選標記，構建了杜氏鹽藻葉綠體表達載體pchlNl622．CAT，在25心、0．8kV條件下通過電擊法轉入野生型杜氏鹽藻中。為實現(xiàn)葉綠體的穩(wěn)定轉化，必須有適宜的選擇壓力，有效地殺死未轉入外源基因和未有效整合的藻株，并使轉入整合的外源基因順利地實現(xiàn)同質化。本實驗針對杜氏鹽藻CCAPl9／18，對各類常用抗生素的敏感性進行了篩選，并
5、對其敏感的氯霉素進行了粗篩和細選，最終確定CCAPl9／18葉綠體轉化的氯霉素選擇濃度為300}tg／ml。結果表明：通過電擊法將載體pUC．chlNl622．CAT轉入CCAPl9／18葉綠體中，在300肛g／ml的選擇壓力下，野生藻在7．8天死亡，而轉化藻則繼續(xù)生長，PCR擴增鑒定表明CAT基因已整合入CCAPl9／18葉綠體基因組中。關鍵詞：杜氏鹽藻CCAPl9／18葉綠體轉化catIIAbstractConstructionoftransformationvectorpchlN-．CAT-BARforchloroplastofDunaliella
6、salinaIIltherecentyears．a(chǎn)sanewkindoftransgenicbioreactor，themicroalgaehavereceivedconsiderableattentionandbeengettingmorefavorjustbecausetheiradventagessuchasfewergrowthtime,lowercostofproductionandbeingeasierfortransgcnicmanipulationcomparedtootherexpressionsystemssuchasescheric
7、hiacoli，yeast，transgenicanimalsandplants．Dunaliellasalinaisaunicellular,halophilicgreenalgabelongingtoheClorophyceae，andamongthemostimportantlysalttolerantmicroalgae．Itcansurvivein0．05．5．5MNaCl，andissuitableforlarge—scaleopenculture．Presently，theresearchontransgenicmodelorganisms
8、suchasChlamydomonashasalreadybecomemorea
