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《特異性靶向乙型肝炎病毒x基因的人工轉(zhuǎn)錄因子的構(gòu)建》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、重慶醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文特異性靶向乙型肝炎病毒X基因的人工轉(zhuǎn)錄因子的構(gòu)建姓名：李鑫申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：外科學(xué)指導(dǎo)教師：吳忠均201205重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文特異性靶向乙型肝炎病毒X基因的人工轉(zhuǎn)錄因子的構(gòu)建1摘要目的：設(shè)計(jì)出一種新型的人工轉(zhuǎn)錄因子(artificialtransc“ptionfactor，ATF)，使其能夠特異性結(jié)合于乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus，HBv)X基因啟動子區(qū)域的靶序列，通過下調(diào)X基因來干擾和抑制HBVDNA的正常的復(fù)制和表達(dá)，為乙型肝炎的基因治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法：(1)通過生物信息學(xué)工具獲取人工鋅指
2、蛋白(zincfingerprotein，ZFP)氨基酸序列，經(jīng)過密碼子優(yōu)化后構(gòu)建重組質(zhì)粒pEGFP—N1一ZFP，將其轉(zhuǎn)染COS-7真核表達(dá)細(xì)胞，通過觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)、RT-PCR和Westernblot檢測其在真核細(xì)胞中的表達(dá)；(2)構(gòu)建含有ZFP結(jié)合結(jié)構(gòu)域和KRAB效應(yīng)結(jié)構(gòu)域的ATF，將其轉(zhuǎn)染COS-7真核表達(dá)細(xì)胞，通過RT—PCR和Westernblot檢測其在真核細(xì)胞中的表達(dá)；(3)將pcDNA3．1(+)一ATF轉(zhuǎn)染HepG2．2．15細(xì)胞，通過酶聯(lián)免疫法ELISA、細(xì)胞免疫組化、熒光定量方法、RT-PCR等方法檢測其對HBVDNA復(fù)制和
3、表達(dá)的抑制作用。結(jié)果：(1)成功構(gòu)建了pEGFP—N1-ZFP重組質(zhì)粒，并驗(yàn)證其在COS-7細(xì)胞中的表達(dá)；(2)成功構(gòu)建ATF，并驗(yàn)證本課題由國家自然科學(xué)基金(81171562)資助重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文其具有相應(yīng)的生物學(xué)活性；(3)成功驗(yàn)證了重組質(zhì)粒pcDNA3．1(+)一A_TF能夠抑制HepG2．2．15細(xì)胞內(nèi)HBVDNA的復(fù)制和表達(dá)。結(jié)論：針對HBVX基因靶序列設(shè)計(jì)出來的ATF能夠抑制HepG2．2．15細(xì)胞內(nèi)HBVDNA的復(fù)制和表達(dá)。關(guān)鍵詞：人工轉(zhuǎn)錄因子：鋅指蛋白：乙型肝炎病毒x蛋白：乙型肝炎病毒：HepG2．2．15細(xì)胞CONSTRUC
4、TIONOFARTIFICIALTRANSCRIPTIONFACTOROFSPECIFICBINDINGTOXGENEPROMOTEROFHEn姐ITISBVIRUSABSTRACTOBJECTIVE：TodesignanovelartificialtranscriptionfactorofspecificbindingtoXgenepromoterofhepatitisBvirus，whichcoulddecreasetheexpressionofHBVXgenetoinhibitethereplicationandexpressionofHBVDNAi
5、IlHepG2．2．15cells．ThestudywillprovidetheexperimentsbasisforgenetherapyofhepatitisBvirus．METHODS：(1)ZFPgenewassynthesizedandclonedintopEGFP．N1plasmidstoconstructtherecombinantplasmidspEGFP．N1-ZFP．RecombinantplasmidsweretransformedintoCOS．7cellsandtheexpressedEGFPwasobservedunderflu
6、orescentmicroscopeandtheZFPexpressionwasdetectedbyRT-PCRandWesternblot．(2)ATFwasconstructedsuccessfully,containingaDNA—bindingdomainofZFPandafunctionaldomainofKRAB．(3)RecombinantplasmidsweretransformedintoHepG2．2．15cells，detectedtheefficiencyofsuppressionofthereplicationandexpress
7、ionofHBVDNAbyELISA、immunocytochemistry、RT-PCR．RESULTS：(1)Recombinanteukaryoticexpressionvectorsof4重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文pEGFP--N1·-ZFPwereconstructedandexpressedsuccessfullyincos7cells．(2)ATFwasconstructedsuccessfullyandwhichcouldexpressnormallyineukaryoticcells；theEMSAresultsdemonstrate
8、dthatATFcouldbindspecificallytoHB
