對褐飛虱高毒力的真菌菌株篩選及其應用研究

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1、安徽農(nóng)業(yè)大學博士學位論文對褐飛虱高毒力的真菌菌株篩選及其應用研究姓名：李茂業(yè)申請學位級別：博士專業(yè)：農(nóng)業(yè)昆蟲與害蟲防治指導教師：林華峰201206摘要褐飛虱朋地陽n，口缸如僭B凇St亂是我國及東南亞地區(qū)一種遠距離遷飛性水稻重要害蟲。為了尋求對該蟲生物防治的新途徑，本論文在既有資料的基礎上，進一步篩選對褐飛虱高毒力的真菌菌株，系統(tǒng)研究了所得高毒力黃綠綠僵菌施細砌訝刪加VDw刪匆(Mf)菌株的生物學特性、對褐飛虱不同蟲態(tài)的毒力以及致病機理，研制了該菌株乳懸劑劑型，并對黃綠綠僵菌(Mf)菌株的固相發(fā)酵培養(yǎng)基組分的配方進行了優(yōu)化，為防治褐飛虱真菌殺蟲劑的開發(fā)與規(guī)?；?/p>

2、產(chǎn)提供有價值的技術(shù)資料。本研究主要獲得以下結(jié)果：1、從褐飛虱Ⅳ玩妒刀s罹病蟲體上新分離出的一種黃綠綠僵菌菌株M．觸vD訂盹如(Mf)，與實驗室保存的黃綠綠僵菌、金龜子綠僵菌和白僵菌3種菌種5個菌株作對比，研究了在SDAY和PDA培養(yǎng)基上的培養(yǎng)性狀，并測定了它們對褐飛虱成蟲的毒力。結(jié)果表明：在SDAY培養(yǎng)基上，6個菌株菌落特征差異明顯，Mf菌株菌落直徑增長量最大，產(chǎn)孢量最高，分別為2．59mm，17．34×107孢子／cm2。與其它菌株相比差異顯著。Mf菌株在SDAY培養(yǎng)基上生生長優(yōu)于PDA，Mf菌株對褐飛虱成蟲具有很強的毒力，以1．0×108孢子／mL的孢子液

3、接種到褐飛虱成蟲體表上，累積校正死亡率達83．8％，LT50為4．47d，致死率明顯高于其他真菌。2、用分子生物學主方法對褐飛虱成蟲高毒力真菌菌株進行了鑒定。采用氯化芐法、CTAB法以及裂解液法分別提取了該菌的基因組DNA；以ITSl和ITS4為綠僵菌通用引物，對供試菌株的rDNAITS序列進行PCR擴增、瓊脂糖凝膠電泳檢測和序列分析，并在核酸序列數(shù)據(jù)庫中進行同源序列對比。實驗結(jié)果表明裂解液法提取的該種綠僵菌的基因組DNA純度高且質(zhì)量好，氯化芐法次之，CTAB法不適合提取此菌的基因組DNA；分子鑒定結(jié)果顯示該菌為綠僵菌屬黃綠綠僵菌(M．肋VDv刪沈)。明確侵染

4、褐飛虱的綠僵菌種類，進而掌握其生物學征和對寄主的致病性。3、對新分離鑒定黃綠綠僵菌Mf82菌株，將其與實驗室保存的8株綠僵菌Mspp．一起，分別測定其對褐飛虱成蟲毒力和幾丁質(zhì)酶活力，并用掃描電鏡觀察了Mf82菌株侵入昆蟲表皮的過程和體表的形態(tài)變化，進而分析侵入能力與幾丁質(zhì)酶的相關性。結(jié)果表明：菌株Mf82累計校正死亡率和幾丁質(zhì)酶活力均最高，為82．1％和9．78U／mg，與其他菌株差異顯著。同時，掃描電鏡照片顯示Mf82分生孢子既可以由褐飛虱體壁節(jié)間膜和凹陷處侵入，還可以從含幾丁質(zhì)較多的胸部背板侵入，可見篩選的Mf82菌株對褐飛虱成蟲致病力強。比較9株綠僵菌菌

5、株菌落生長速度、產(chǎn)孢初始時間、產(chǎn)孢量和萌發(fā)率顯示，Mf82菌株具有生長速度快、產(chǎn)孢初始時間短、萌發(fā)率高和產(chǎn)孢量大等優(yōu)點。4、利用黃綠綠僵菌M加陽1，f砒把82菌株五種濃度5296．5368、1055—1121、585．623、126．144和22．31孢子／mm2侵染不同齡期褐飛虱成蟲和若蟲并以1100孢子／mIn2孢子懸浮液侵染褐飛虱懷卵雌成蟲、雌成蟲、雄成蟲和不同齡期卵。結(jié)果表明：其不同濃度孢子液對褐飛虱3個發(fā)育階段有不同程度的致病力，毒力大小順序為成蟲>高齡若蟲>低齡若蟲。同時，Mf82菌株對不同性別褐飛虱成蟲的敏感性順序為懷卵雌成蟲>雌成蟲>雄成蟲。黃

6、綠綠僵菌孢子液對各處理稻株褐飛虱產(chǎn)卵痕部位、卵粒均有侵染作用，10d侵染率分別為66．7％和51．2％，卵齡越低，侵染效果越好，卵齡為0．5d時侵染率最高。本研究表明黃綠綠僵菌Mf82菌株對褐飛虱成蟲、若蟲和卵均有較強的致病性，5、利用掃描電鏡觀察了黃綠綠僵菌M．肋Ⅷ1，f訂沈菌株分生孢子對褐飛虱的侵染過程。結(jié)果表明：分生孢子多分布在褐飛虱節(jié)間膜、體表的褶皺凹陷等部位，主要以芽管或產(chǎn)生附著胞入侵，然后在體表長出菌絲和產(chǎn)孢。菌體進入寄主血腔后，利用體腔內(nèi)營養(yǎng)大量增殖、擴散并侵染褐飛虱卵巢中的卵塊。侵染卵塊的菌絲雖被體液包裹但依然能繼續(xù)生長，使卵粒失活，抑制害蟲下

7、代的數(shù)量。通過體表及體內(nèi)的侵染過程，可直觀地表現(xiàn)黃綠綠僵茵對褐飛虱的侵染能力和侵入方式，為評價該菌的殺蟲作用和應用前景提供了證據(jù)。6、用新分離出的黃綠綠僵菌肱伽陽v塒沈(Mf82)菌株與實驗室保存的黃綠綠僵菌、金龜子綠僵菌和白僵菌3種菌種9個菌株作對比，測定了它們的懸乳劑對褐飛虱成蟲的毒力。結(jié)果表明：Mf82菌株對褐飛虱成蟲的毒力最高，以1．0×108個孢子／mL的孢子懸乳劑噴霧接種到褐飛虱成蟲體表上，累積死亡率高達81．7％，LT50為4．6d，致病效果顯著高于其他受測菌株。在此基礎上研制了黃綠綠僵菌懸乳劑，并研究了其對褐飛虱的致病力。結(jié)果表明：隨著黃綠綠僵

8、菌濃度的增加，褐飛虱的累計死亡率增加，