新生大鼠肺泡ⅱ型上皮細(xì)胞原代分離、培養(yǎng)和鑒定

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1、新生大鼠肺泡II型上皮細(xì)胞原代分離、培養(yǎng)和鑒定摘要：目的探究新生大鼠肺泡II型上皮細(xì)胞(alveolartypeIIepithelialcell,AT-II)的原代分離、培養(yǎng)及鑒定方法，建立體外細(xì)胞模型。方法取SPF級新生Wistar大鼠肺臟，采用胰蛋白酶聯(lián)合膠原酶消化法分離AT-II,免疫黏附法純化細(xì)胞，體外培養(yǎng)并進(jìn)行傳代研究，透射電鏡鑒定細(xì)胞。結(jié)果AT-II細(xì)胞原代培養(yǎng)和傳代研究成功，細(xì)胞生長狀態(tài)良好。電鏡觀察到板層小體。結(jié)論采用改良方法獲得的AT-II細(xì)胞符合體外實(shí)驗(yàn)要求，第24?72h內(nèi)處于最佳生長狀態(tài)，是進(jìn)

2、行實(shí)驗(yàn)研究的良好時(shí)間段。關(guān)鍵詞：新生大鼠；肺泡II型上皮細(xì)胞；原代培養(yǎng)；鑒定肺泡II型上皮細(xì)胞(alveolartypeIIepithelialcells,AT-II)是肺泡上皮細(xì)胞的干細(xì)胞，又被稱為”顆粒性肺泡細(xì)胞”和”分泌細(xì)胞”，是一種多功能細(xì)胞。AT-II除了能增殖成新的AT-II細(xì)胞，還可分化為肺泡I型上皮細(xì)胞(alveolartypeIepithelialcell,AT-I)[1]。AT-I和AT-II共同組成肺泡上皮屏障。AT-II約占肺泡細(xì)胞群的60%[2],細(xì)胞形態(tài)為多角形、立方形或圓形，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有大

3、量反差明顯的細(xì)小顆粒。應(yīng)用AT-II開展相應(yīng)研究，對認(rèn)識肺的正常生理功能和多種肺部疾病有重要意義。原代培養(yǎng)、分離、純化可以排除其他肺組織細(xì)胞對AT-II的影響［3］。有文獻(xiàn)報(bào)道AT-II易變性、易分化，表型喪失快,基本不能傳代［2］。亦有文獻(xiàn)報(bào)道它具有無限增殖的潛能［4］。本次實(shí)驗(yàn)在借鑒他人實(shí)驗(yàn)方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行了簡化改良，順利進(jìn)行了AT-II的原代培養(yǎng)、分離、純化與鑒定，并進(jìn)行傳代研究。1資料與方法1.1實(shí)驗(yàn)動物SPF級新生24h內(nèi)Wistar大鼠，由甘肅中醫(yī)學(xué)院科研試驗(yàn)中心SPF級實(shí)驗(yàn)室提供。1.2實(shí)驗(yàn)試劑DMEM

4、培養(yǎng)基、PBS緩沖液、胎牛血清、0.2%膠原酶、0.5%胰蛋白酶、10%水合氯醛、75%乙醇、IgG溶液、100U青霉素、100U鏈霉素、5%戊二醛。1.3方法1.3.1新生大鼠AT-II細(xì)胞的原代分離取SPF級新生24h內(nèi)Wistar大鼠，借鑒張秋月［5］等的方法加以改良進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。10%水合氯醛麻醉乳鼠(0.3ml/100g),放入75%乙醇消毒Imino在超凈臺內(nèi)進(jìn)行無菌操作，取出肺組織，將其置于盛有5ml預(yù)冷PBS的無菌培養(yǎng)皿中，去除氣管、支氣管和小血管等組織，吸棄液體和雜質(zhì)，再用無菌PBS反復(fù)沖洗直至液體

5、澄清，吸棄液體后用無菌手術(shù)剪將其剪成lmm3碎塊。將其轉(zhuǎn)移至10ml無菌離心管中，加入0.2%膠原酶6ml,置于37￡恒溫震蕩水浴箱內(nèi)消化lh,再加入4ml0.5%胰蛋白酶消化30min,4°C條件1500r/min離心5min,棄上清。加10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基5ml終止消化，吹打均勻，200目金屬濾網(wǎng)過濾細(xì)胞懸液，將細(xì)胞濃度調(diào)至（2?3）X106個(gè)/ml。1.3.2AT-II細(xì)胞的純化借鑒Dobbs[6]等采用的IgG吸附純化法對AT-II細(xì)胞進(jìn)行純化。將調(diào)整好濃度的AT-II細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)移至事先制備好的用

6、大鼠IgG包被的無菌培養(yǎng)皿中，置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱孵育90?120min,移出未黏附的細(xì)胞，4°C條件800r/min離心lOmin,棄上清[6-7]o1.3.3細(xì)胞培養(yǎng)取細(xì)胞沉淀，用DMEM完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素）重懸細(xì)胞于一次性無菌培養(yǎng)瓶中，調(diào)整細(xì)胞濃度為（2?3）X106個(gè)/ml,置于37°C,5%C02孵箱內(nèi)。培養(yǎng)24h后，移除未貼壁細(xì)胞，無菌PBS洗2次，用完全培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞換液。在倒置相差顯微鏡下觀察不同培養(yǎng)時(shí)間后細(xì)胞的貼壁生長情況和形態(tài)特征變化

7、。1.3.4細(xì)胞鑒定AT-II的鑒定方法有多種，如透射電鏡、免疫組織化學(xué)、免疫熒光染色、堿性磷酸酶（AKP）染色鑒定等。電鏡下可清楚觀察到AT-II胞質(zhì)內(nèi)的特征性板層小體（嗜餓小體），是鑒定AT-II的金標(biāo)準(zhǔn)[1],故釆用該法進(jìn)行細(xì)胞鑒定。用0.25%胰酶消化細(xì)胞，胎牛血清終止消化，稍作吹打后lOOOr離心7min,棄上清，加0.5ml5%戊二醛固定。制備為電鏡細(xì)胞標(biāo)本，于透射電鏡下觀察。2結(jié)果2.1細(xì)胞生長狀態(tài)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：新生大鼠AT-II細(xì)胞原代培養(yǎng)24?36h大量貼壁，呈島狀生長；36?48h,細(xì)胞平展呈多邊

8、形或圓形，相互連接成細(xì)胞單層，胞質(zhì)內(nèi)有大量反差明顯的細(xì)小顆粒，細(xì)胞核明顯；48?72h,細(xì)胞大量增殖，是生長最旺盛、活力最強(qiáng)的時(shí)期；第4?5d,細(xì)胞形態(tài)逐漸拉長，變扁平，胞內(nèi)顆粒逐漸減少；第6?7d,細(xì)胞特征難以清晰辨認(rèn)。其生長過程經(jīng)歷了增殖、停滯、凋亡3個(gè)時(shí)期，生化特性變化快，在24?72h內(nèi)處于最佳生長狀態(tài)［8］o增殖期是進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)的良好