sd大鼠腎小管上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)和鑒定

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1、SD大鼠腎小管上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)和鑒定：何錦園,曾國華,吳文起,鐘文,桂志明,麥贊林【摘要】目的：探討大鼠腎小管上皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)及鑒定方法，為腎結(jié)石病的研究提供實(shí)驗(yàn)平臺。方法：采用機(jī)械研磨、Ⅰ型膠原酶消化法分離出腎小管節(jié)段，在含10%胎牛血清和1%上皮細(xì)胞生長因子的上皮細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶消化后傳代培養(yǎng)，并用原代和傳1代細(xì)胞做免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定。結(jié)果：細(xì)胞培養(yǎng)至第3天完全貼壁，4～7d處于對數(shù)生長期，為多邊鵝卵石樣;免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示cytokeratin18表達(dá)陽性。結(jié)論:機(jī)械研磨、Ⅰ型膠原酶消化法結(jié)合使用上皮細(xì)胞培養(yǎng)基

2、可以培養(yǎng)得到較純的腎小管，是大鼠腎小管上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)的理想方法,為進(jìn)一步研究泌尿系結(jié)石病因和機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)?！娟P(guān)鍵詞】腎小管上皮細(xì)胞;原代培養(yǎng);CK18;大鼠　　[Abstract]Objective：TodiscussthemethodoftheprimarycultureandidentificationofSDratsrenaltubularepithelialcells,thustosupplyanexperimentalplatformforthestudyofrenalcalculi.Methods：Therenaltubu

3、larsegmentsechanicalgrindingandcollagenaseⅠdigestion.Thecollectedcellsmunocytochemistry.Results:Theculturedcellsicgromunocytochemistrysuggestedthattheexpressionsofcytokeratin18inrenaltubularepithelialcellsethodtocollectandculturetherenaltubularepithelialcells,anditprovidesth

4、eexperimentalbasisforfurtherstudyoftheetiologyandmechanismofurinarytractstones.　　[Keyaryculture;CK18;rats　　尿石癥是泌尿外科最常見的疾病之一，主要病因包括遺傳、環(huán)境、飲食、代謝等。一般認(rèn)為,它的形成是一系列化學(xué)的、生化的、生理的及分子調(diào)節(jié)等因素綜合作用的結(jié)果[1]，其早期病變是微小晶體黏附在腎小管上皮細(xì)胞表面并引起損傷?？梢姡I小管上皮細(xì)胞可以作為進(jìn)一步研究尿石癥病因及發(fā)病機(jī)制的一個(gè)實(shí)驗(yàn)平臺。目前，國外已建立部分種屬的腎小管上皮細(xì)胞株，但價(jià)

5、格昂貴且不易獲得。本實(shí)驗(yàn)旨在探討一種理想的腎小管上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)方法?！　?材料和方法　　1.1材料　　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SD大鼠2只，一雄一雌，體重分別為220g和200g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供[許可證號為SCXK(粵)20080020粵監(jiān)證字2008A002]。主要試劑：胎牛血清(Gibco公司)、上皮細(xì)胞培養(yǎng)基EpiCM(美國ScienCell公司)、Ⅰ型膠原酶(Sigma公司)、胰蛋白酶(Gibco公司)、青/鏈霉素(Sigma公司)、cytokeratin18一抗(美國SantaCruz公司)、山羊抗小鼠二抗(北京博奧森公司)、

6、上皮細(xì)胞生長因子EpicGs(美國ScienCell公司)、PV9005小鼠超敏二步法免疫組化試劑盒(北京中杉金橋)、ZLI9017濃縮型DAB試劑盒(北京中杉金橋)。主要儀器：80和100目不銹鋼篩網(wǎng)(廣州普博生物公司)、XDS1B型倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)、熒光倒置顯微鏡(日本Olympus公司)、CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo公司)?！　?.2方法　　1.2.1腎小管節(jié)段的分離提取大鼠實(shí)驗(yàn)前禁食12h，水?dāng)z入不限。頸椎脫臼后于70%酒精中浸泡2～3min后取出，在超凈臺上無菌取下兩側(cè)腎臟。在盛有PBS培養(yǎng)皿中去除腎蒂

7、和包膜，剪碎腎皮質(zhì)至約1mm3大小(冰上操作)，PBS反復(fù)沖洗3遍去除血質(zhì)后轉(zhuǎn)移到80目篩網(wǎng)上，研磨并以PBS充分沖洗，網(wǎng)下液體倒至100目篩網(wǎng)上，收集網(wǎng)上物于培養(yǎng)皿中，反復(fù)吹打轉(zhuǎn)至15ml離心管，1200轉(zhuǎn)·min-1離心10min?！　?.2.2腎小管節(jié)段的消化和腎小管上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)離心后棄上清，加入1mg·ml-1的Ⅰ型膠原酶2ml,0.1mg·ml-1的DNase0.1ml,充分混勻，37℃水浴震蕩消化約30min，加入不含血清的EpiCM2ml終止消化，混勻，1600轉(zhuǎn)·min-1離心6min，棄去上清，加入4ml含10%胎牛血清

8、、1%上皮細(xì)胞生長因子、1%雙抗的上皮細(xì)胞培養(yǎng)基EpiCM，吸管充分輕輕混勻后移入25cm2培養(yǎng)瓶中，在5%CO2、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)?！　?.2