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《flk-1_272b_間充質(zhì)干細(xì)胞分化機(jī)制研究》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院博士研究生學(xué)位論文(GibeoBRL公司)；p．巰基乙醇(13-mercaptoethanohMerck公司)；堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basicfibroblasticgrowthfactor,bFGF；Sigma公司)；內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF；Sigma公司)；表皮細(xì)胞生長因子(epidermalgrowthfactor，EGF；Gibeo公司)；gltd,板衍生生長因子(platelet-derivedgrowthfactorBB，P
2、DGF—BB：Sigma公司)；胰島素一轉(zhuǎn)鐵蛋白一亞硒酸(Insulin．Transferrin．SeleniuIIl，ITS；Sigma公司)；亞油酸．牛血清白蛋白(1inoleicacid．bovineserumalbumin，LA．BSA；Sigma公司)；氫化可的松(hydrocortisone；Sigma)；皂素(saponin；Sigma公司)；碘化丙錠(PI：Sigma公司)；流式抗體：CD29、CD3l、CD34、CD44、CD45、CDl05、Flk．1、CDl84、CD71、CD3、CDl9、CDl3、HLAcla
3、ssI和HLA．DR(均購自BDBioscience公司)；蛇毒毒素(cardiotoxm，CTXl；Sigma公司)；免疫組化試劑(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司)；Western檢測抗體：兔抗人EIDl單克隆抗體(購I芻Upstate公司)；免疫熒光試劑：兔抗山羊IgG．fluoresceinisothyocyanate(FITC)和大鼠抗小鼠IgG．TRITC(均購自SantaCruz公司)；CDl33+磁珠分選試劑盒、細(xì)胞分選專用磁力架、細(xì)胞分選柱(均購自MACS公司)；小IⅢA分離純化試劑盒：miRNAIsolationKit(購
4、ElAmbion公司)；5’【y．32P】探針標(biāo)記試劑盒(購自TAKARA公司)：【y．32P】ATP(購自北京福瑞公司)；RNA力H尾酶、RNAT4連接酶(均購買自TAKARA公司)：CFUMⅨ半固體培養(yǎng)基(購自StemCell公司)：小I斟A芯片定制委托北京博奧公司完成。二實(shí)驗(yàn)儀器l、37"(2恒溫、5％C02細(xì)胞培養(yǎng)箱(TherrnaForma)2、無菌操作臺(北京半導(dǎo)體設(shè)備～廠)3、25cm2、75cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶(Coming公司)、6孔板、24孔板、96孔板(美國costal"公司)4、常溫臺式離心機(jī)(德I虱Heraeus
5、sepatech)，低溫臺式離心機(jī)(美I垂ISigma公司3k20型，德國Hemeus公司Labofuge450R型)5、WH．2微型漩渦混合儀(上海滬西分析儀器廠)7北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院博士研究生學(xué)位論文6、倒置顯微鏡(日本Olympus公司)7、倒置熒光顯微鏡及照相系統(tǒng)(日本Nikon公司)8、分析天平(美國METTLER公司AE200型)9、電動移液器(德國ACCU．JET公司)10、電熱恒溫干燥箱(湖南長沙醫(yī)用儀器廠)1l、流式細(xì)胞儀(美國Coulter公司FACSVantage型)12、GeneAmpPCRSyste
6、m2400PCR擴(kuò)增儀(購自美國PE公司)13、DU．70型紫外分光光度計(購自美國Beckman公司)14、正置熒光顯微鏡及照相系統(tǒng)(日本Olympus公司)三、實(shí)驗(yàn)方法lCDl33+造血干細(xì)胞分離臍帶血由北京臍血庫惠贈，遵循知情同意原則。分離方法參照CDl33+CellIsolationKit(Miltenyi)提供的操作步驟，稍作修改，簡述如下：200ml臍血，分裝至4個50ml離心管，2000轉(zhuǎn)離心10min(不帶剎車)，棄上層一半血清，把中間含白細(xì)胞層部分轉(zhuǎn)移至新的血漿瓶中，加入等體積BufferI(PBS含2mMEDTA)
7、稀釋(總體積約120m1)；取4個干凈的50ml離心管，分別加入17mlFic011，將上述血細(xì)胞混合液以30ml／管小心加至Fieoll上層，1800轉(zhuǎn)離心20min，棄2／3血漿，轉(zhuǎn)移白膜層至新的50ml離心管中；用BufferI補(bǔ)齊至約40ml，1200轉(zhuǎn)離心8min，棄上清，BufferI重懸沉淀細(xì)胞團(tuán)，將所有細(xì)胞混合至一個離心管中，BufferI洗兩遍，棄上清；300ulBufferII(PBS含2mMEDTA，0．5％BSA)重懸細(xì)胞，依次加入100ulFcRblockingreagent和100ulCDl33+分選磁珠，
8、輕輕混勻后，4℃孵育30min，加入BufferII至15ml終止反應(yīng)，1200轉(zhuǎn)離心10min，棄上清，500ulBufferII重懸，準(zhǔn)備過柱；分選柱置于磁鐵架上，用lmlBufferII潤柱，加入細(xì)胞懸液過柱，再用
