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1、鄭州大學(xué)碩士學(xué)位論文胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合外周血造血干細(xì)胞移植對(duì)SCID小鼠造血的影響姓名：杜幸軍申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：兒科學(xué)指導(dǎo)教師：劉玉峰201205中文摘要胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合外周血造血千細(xì)胞移植對(duì)SCID小鼠造血的影響研究生：杜幸軍導(dǎo)師：劉玉峰教授鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院d,JDl內(nèi)科鄭州450052研究背景及目的外周血造血干細(xì)胞移植(Peripheralbloodstemcelltransplantation，PBSCT)是目前治療多種實(shí)體瘤和惡性血液病的有效方法。PBSCT的原理主要是用來源于外周血中的
2、造血干／祖細(xì)胞重建患者的免疫和造血功能。PBSCT與傳統(tǒng)的骨髓移植相比較，有如下優(yōu)點(diǎn)：移植后患者免疫恢復(fù)早，造血重建快，出血、感染機(jī)會(huì)少，成分輸血和抗生素的應(yīng)用減少，移植后死亡率低；采集PBSC方便，避免穿刺引起的痛苦；多發(fā)性骨髓瘤和侵犯骨髓的患者，腫瘤細(xì)胞浸潤骨髓、骨質(zhì)破壞、骨盆局部放療無法采集骨髓，可采集PBSC代替；和骨髓相比較，外周血中的腫瘤細(xì)胞混入較少，移植后復(fù)發(fā)率相對(duì)較低：PBSCT后的免疫功能重建較早，且回輸了大量的T細(xì)胞、NK細(xì)胞和單核細(xì)胞，理論上有可能移植物抗腫瘤細(xì)胞效應(yīng)在移植后得到增強(qiáng)，能夠
3、清除殘留的病灶，減少其復(fù)發(fā)。近年來，PBSCT逐漸替代了骨髓造血干細(xì)胞的移植。通常認(rèn)為間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcells，MSCs)是一種多能干細(xì)胞，具有增殖和分化潛能，可以分化為中胚層和外胚層的細(xì)胞，其中包括軟骨細(xì)胞，骨細(xì)胞，肌細(xì)胞，成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞，也有可能分化為神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等。可以作為造血微環(huán)境的一種主要細(xì)胞成分(骨髓基質(zhì)的前體細(xì)胞)，它在造血調(diào)控中起著重要的作用，對(duì)血細(xì)胞的發(fā)育、生成具有非常重要的調(diào)節(jié)和支持作用，能下調(diào)免疫反應(yīng)，使移植物抗宿主病(GVHD)很少發(fā)生。其
4、中，骨髓來源的MSC的應(yīng)用更加廣泛。但是MSC在骨髓和外周血等組織中的含量中文摘要極低，僅僅占到骨髓細(xì)胞的l／104～1／105。并且有研究表明隨著年齡的增長骨髓中的MSC含量會(huì)逐步降低，同時(shí)由于其伴有細(xì)胞增殖分化能力的大大降低，所以其應(yīng)用受到一定的限制。近些年來，通過研究發(fā)現(xiàn)了胎盤問充質(zhì)干細(xì)胞(placentalmesenchymalstemcells，PMSC)較骨髓具有多個(gè)方面的優(yōu)勢，取材不受限，胎兒只要娩出，胎盤就成為廢物，只要產(chǎn)婦同意，都可以提供胎盤；污染機(jī)會(huì)少，供者無痛苦；不受道德和倫理的約束；所以
5、對(duì)捐獻(xiàn)者沒有任何傷害。人胎盤MSC免疫原性較低，可通過MHC屏障，在免疫調(diào)節(jié)、造血及細(xì)胞歸巢植入等方面起著非常重要的作用。張毅等通過實(shí)驗(yàn)說明，胎盤MSC對(duì)造血干細(xì)胞的體外擴(kuò)增和支持作用比較肯定。HSC移植(HSCT)成功的必需條件是足夠量的HSC／HPC。如果HSC的數(shù)量少，患者的無髓期將變長，使移植失敗幾率增高，危急患者的生命。所以現(xiàn)在越來越重視HSC在體外的擴(kuò)增。本課題組通過前期研究的結(jié)果顯示：胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞具有體外造血支持作用，其可為造血干細(xì)胞提供造血的微環(huán)境，抑制其分化，促進(jìn)其擴(kuò)增。用作臍血，骨髓，胎
6、盤等來源造血干細(xì)胞在體外擴(kuò)增的滋養(yǎng)層，對(duì)胎盤來源的造血干細(xì)胞的效果最好。本實(shí)驗(yàn)是在前期研究胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞在體外對(duì)不同來源造血干細(xì)胞體外擴(kuò)增支持作用比較的基礎(chǔ)上探討人胎盤問充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)外周血造血干細(xì)胞在scid小鼠體內(nèi)造血重建的影響。材料：1．胎盤：正常新鮮健康的胎盤組織來源于鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院產(chǎn)科。2．外周血造血干細(xì)胞：外周血造血干細(xì)胞來源于鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院移植科造血干細(xì)胞捐獻(xiàn)者。3．Scid小鼠：8．10周齡雄性scid小鼠購于北京華阜康生物科技股份公司。4．主要試劑：胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、PBS
7、液均購于美國Hyclone公司，紅細(xì)胞裂解液購于Sigma公司，膠原酶Ⅳ購于Solarbio公司，胰蛋白酶消化液購于北京。5．細(xì)胞因子和抗體：單克隆抗體抗CD44、CD45、CDl05、CDl9、CD29、CD34、CDl06、HLA．DR、HLA-ABC及UEA．1均購于PharMingen公司。方法1．胎盤問充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定：在無菌條件下取胎盤組織，用ⅣⅡ中文摘要型膠原酶消化，用100目不銹鋼篩網(wǎng)過濾，獲得的細(xì)胞懸液接種含10．．20％胎牛血清的培養(yǎng)瓶中，37"C、5％C02孵育箱內(nèi)培養(yǎng)，48．7
8、2h后換液去除未貼壁細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)，每3天全量換液一次，細(xì)胞按貼壁細(xì)胞的常規(guī)方法傳代。取第3代以后的細(xì)胞，然后分別加入PE或FITC標(biāo)記的鼠抗人單克隆抗體，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表型。2．外周血造血干細(xì)胞的分離：通過人類粒細(xì)胞集落刺激因子(G．CSF)動(dòng)員外周血造血干細(xì)胞捐獻(xiàn)者，第5天開始采集。此時(shí)我們通過外周靜脈單采術(shù)而獲得PBSC，所采的干細(xì)胞和粒細(xì)胞通過離心與紅細(xì)胞和血漿等成分分離，
